Електрофореза со 2Д гел - биологија

На дводимензионална електрофореза на гел или Електрофореза со 2Д гел е аналитички метод во биохемијата, молекуларната биологија и протеомиката. Развиен е во 1975 година од О'Фарел [1] и Клосе [2] независно. Комбинира изоелектрично фокусирање (IEF) со електрофореза на гел полиакриламид на СДС (SDS-PAGE) за да се одделат комплексни мешавини на протеини (бактериски лизати, лизати од повисоки клетки или ткива, телесни течности) во индивидуални протеини. Особено одвојување со висока резолуција се постигнува преку комбинација на двете техники на ортогонално одвојување.

Секое место во протеинската шема одговара на еден вид (вид) на протеински молекули. Бидејќи протеинските обрасци во биолошките системи се менуваат во зависност од околината и состојбата, тие можат да се користат за разликување помеѓу оштетените и здравите или оптимално и субоптимално одгледуваните клетки. На пример, тие даваат информации за причините за болеста или механизмот на дејство на лековите на молекуларно ниво. Поради комплексноста на дводимензионалните протеински обрасци, за нивна проценка се користат специјално развиени компјутерски програми.

Подготовка на примерок

Примерокот е добиен и обработен во што е можно по идентични услови. Ова ја исклучува можноста, покрај експерименталните варијабли што треба да се испитаат, влијанијата на фалсификување дејствуваат врз примерокот. Протеините претежно се таложат од вонклеточните живеалишта (секретирани протеини). Интрацелуларните протеини се извлекуваат со нежно уништување на клеточните структури. Надвор од нивната природна средина, протеините се особено подложни на формирање на агрегати и деградација од протеазите. Понатаму, подготовката на примерокот се изведува на близу 0 ° С. Како по правило, се додаваат уреа и нејонски детергенти, како и супстанции кои го инхибираат протеазата, со цел да се избегнат интеракции и промени во протеините.

Прва димензија (IEF)

За време на IEF (прва димензија), протеинскиот екстракт се одделува еднодимензионално во гел за градиент на pH во електрично поле. Киселите и основните аминокиселински остатоци на протеините минуваат низ различни (де) протонациони состојби во зависност од pH вредноста на околината и со тоа се одредува полнењето на протеините. Затоа се одговорни за влијанието на електричното поле врз протеините. На изоелектричната точка (pI), позитивните и негативните полнежи на протеинот се откажуваат едни со други. PI одговара на pH на која протеинот има нето полнење од нула. Електричното поле повеќе не делува како сила на сега неутрално полнежниот протеин и протеинот се таложи. Промените во локацијата во соседните рН опсези предизвикани од дифузија доведуваат до обновување на електричното полнење на протеините. Сепак, ре-ефективното електрично поле веднаш го промовира протеинот назад во неговата изоелектрична точка. Две различни IEF технологии се достапни.

Имобилизирани рН градиенти (IPG): Гел-лентата се состои од матрица на полиакриламид. Едниот крај на гел-лентата содржи деривати на акриламид со кисели странични ланци во матрицата, и оние со алкални функционални групи од другата страна. Кополимеризацијата на неутралниот акриламид со кисели и основни деривати додадени во градиентот создава непроменлив, неподвижен градиент на pH.
pH-градиенти засновани на носители на амфолити: Носачите-амфолити се синтетички аминокиселини и слободно се движат во лента за гел или долг цилиндричен гел (обично во цевка). Кога се применува електрично поле, тие формираат градиент на pH, кој, сепак, е нестабилен со текот на времето. Со зголемување на времето, носачите на полнеж што го дефинираат градиентот мигрираат кон гелот, завршуваат и порано или подоцна го деформираат својот тек.

Изедначување

Во таканаречената рамнотежа, која следи по одвојувањето по pI, гелот со протеините првично се намалува (на пример, со меркаптоетанол или дитиотреитол). Ова служи за отстранување на дисулфидните мостови. Со цел да се спречи реоксидација на добиените -SH HS групи за дисулфидни групи (-S-S-), во следниот чекор HS групите z. Б.алкилиран со јодоацетамид. Конечно, протеините се натоварени со натриумодецил сулфат (СДС). СДС е негативно наелектризиран детергент. За секои 3 аминокиселини, околу една молекула на СДС се врзува за молекулата на протеинот преку неговиот алифатичен крај преку хидрофобна интеракција. Со негативно наелектризираната страна, таа се одбива од наполнетите краеви во близина на врзаните молекули на СДС. Ова доведува до целосно расплетување (линеаризација) на протеинските молекули. Колку е поголема протеинска молекула, толку подолги се добиените ланци натоварени со СДС. Бидејќи, во зависност од должината на протеинот, се врзуваат голем број на негативно наелектризирани молекули на СДС, внатрешниот полнеж за повеќето протеини може последователно да се занемари.

Втора димензија (SDS-PAGE)

Лентата со гел со разделени протеини и изедначена според рН вредноста се става на работ на квадрат или правоаголен гел од полиакриламид кој исто така содржи СДС и протеините сега се одделени според нивната големина нормална на првата димензија во втората електрофореза. Кога ќе се примени електричното поле (анода спроти лентата со гел на IEF), расплетените протеини опкружени со СДС мигрираат со нивниот вишок на негативни полнежи преку гелот, што им нуди на протеините поголема или помала отпорност според нивната молекуларна големина. Малите молекули мигрираат релативно непречено и брзо стигнуваат до работ на гелот свртен настрана од гелот IEF, додека големите молекули постојано се забавуваат од гелот бидејќи мигрираат и тешко прават некој напредок. Раздвојувањето во втората димензија се запира кога малите протеини ќе пристигнат на работ на гелот свртен настрана од гелот IEF. Ова се прави видливо со боја што поминува заедно, како што е синиот бромофенол. За да може протеинскиот образец да остане присутен и по одвојувањето, тој мора да се поправи во последниот чекор. За ова се користат метанол и оцетна киселина. Овие ги денатурираат одвоените протеини и ги поврзуваат со гел-матрицата. Ова спречува дифузија и 2Д моделот е стабилен со текот на времето.