Ензимска олигомеризација на протеини од храна под места на реакција при висок притисок и
Ензимска олигомеризација на протеините од храна под висок притисок: места на реакција и функционални последици ДИСЕРТАЦИЈА за добивање на академска диплома Doctor rerum naturalium (д-р рер. Нат.) Презентирана на Факултетот за математика и природни науки на Техничкиот универзитет во Дрезден од Сузана Шух Поднесена на 10 декември 2012 година Дисертацијата беше во од септември 2007 година до јули 2012 година на професорството за хемија на храна.
Дискусија: 25 април 2013 година Рецензент: проф. Д-р. рер. нат Д-р-Инг. хабил Томас Хенле проф.д-р. рер. нат Харшадраи Равел
Содржина Содржина Список на слики V Список на табели VIII Список на кратенки XI 1 Вовед и цели 1 2 Теоретски основи 3 2.1 Лизозим. 3 2.1.1 Механизми на дејство на лизозимот. 4 2.1.2 Можни употреби на лизозим. 7 2.1.3 Измена на лизозимот. 8 2.1.3.1 Фибрили и амилоидни структури на HEWL. 9 2.1.3.2 Нови биолошки функции преку промена на конформацијата. 13 2.1.4 Еволутивен развој и врска со α-лакталбумин. 14 2.2 Ензимското вкрстено поврзување. 15 2.2.1 Микробна трансглутаминаза. 2.2.1.1. Реакции и механизам на реакција катализирана со ТГаза. 17 2.2.1.2 Аналитички аспекти. 19 2.2.1.3 Употреба во прехранбената индустрија. 19 2.3 Не-ензимско вкрстено поврзување. 21 2.3.1 Термички предизвикано вкрстено поврзување. 21 2.3.2 Вкрстено поврзување со вакуо нула со должина. 23 2.3.3 Можни употреби на не-ензимски поврзани протеини. 23 2.4 Ефект на високи хидростатички притисоци врз протеините. 24 2.4.1 Ефект на висок притисок врз лизозимот на пилешки протеини. 26 2.4.2 Ефект на висок притисок врз микробната трансглутаминаза. 27 3 Експериментален дел 29 3.1 Хемикалии, материјали, уреди и софтвер. 29 3.1.1 Хемикалии. 29 3.1.2 Уреди и потрошен материјал. 31 3.1.3 Материјали за испит. 33 3.1.4 Софтвер. 33 јас
Содржина 4.6.2 Идентификација на формираните изопептиди. 145 4.6.3 Споредба на не-ензимско и ензимско вкрстено поврзување на HEWL.146 4.6.4 Споредба на ин-вакуо термичко вкрстено поврзување на HEWL со β-казеин и први испитувања на изолат на протеин од сурутка. 149 4.7 Заклучок од истрагите за ензимско и не-ензимско вкрстено поврзување на различни протеини. 152 5 Резиме 154 6 Библиографија 157 Публикации 172 Благодарници 173 Осигурување 174 IV
Список на кратенки LMW α-la β-lg Lys m/z Среден мин ML MMW MO MPa MS мтгаза NRT PBS PCR pdb рел. PE RP-HPLC вртежи во минута SDS-PAGE TCA TEM TEMED TGase ThT TPCK Tris U UV Val WHO Z-Glu-Gly ZLCL со низок вкрстен лиззимски примерок со 1000 37 C Arnaudov и de Vries, 2005 ph 2.0; 57 Ц 4,0 ± 0,7> 5000 Ванг и сор. 2009a ph 2.0; 55 В.
10 * 1000 * Frare et al., 2004 ph 2.0; 65 Ц.
10 *> 600 * Као и сор., 2004 pH 4,5; Собна температура; црвено HEWL, 90% етанол Года и др., 2000 90% етанол, 10 mm NaCl, 25 C * проценето со користење на TEM слики 2-5 1000-2000
2 Теоретски основи Покрај тоа, Менендез (2006) беше во можност да покаже дека при пониски температури од 20 C и 600 MPa времето потребно за 50% инактивација се зголемува на околу 100 мин (шесткратно). Понатаму, ензимот е мерливо инхибиран само на собна температура од 400 MPa или при атмосферски притисок од 60 C. Врз основа на овие откритија, чувствителноста на притисок на трансглутаминазата се зголемува со зголемување на температурите (20 C). Инактивирањето на мтгазата е под влијание повеќе на температурата отколку на притисокот и следи реакција од прв ред (Лаубер и сор., 2001а). Целосно деактивирање се одвива при атмосферски притисок по 2 мин и 80 C (Менендез и сор., 2006). Инактивацијата предизвикана од притисок се заснова на распаѓање на α-хеликите во површината на ензимот, што ја менува терцијарната структура, што пак влијае на врзувањето на подлогата (Менендез и сор., 2006). За разлика од HEWL, преклопувањето по третманот со висок притисок се чини нецелосно, бидејќи губењето на активност опстојува кога ќе се намали притисокот. 28
75%, Т3516 Сигма-Олдрих, Штајнхајм Тимол 3209.1 Карл Рот, Трпсин третиран со Карлсруе со ТПЦК од говеда 10.000 единици БАЕЕ/мг Сигма-Олдрих, протеин на панкреасот Стеинхајм, аналитички реагенс Т1426 трихлороцетна киселина (ТЦА) аналитички реагенс ВВР, Дармистад (Дармистад) аналитичко одделение на метилглицин Serva Elektrophoresis, Heidelberg (Tricin) trisodium phosphate dodecahydrate pure, pa VEB Laborchemie, Apolda Tris (hydroxymethyl) -aminomethane (TRIS) buffer grade, A1379 AppliChem, Darmstadt 30
3 Експериментален дел 3.1.3 Тест материјали Табела 3-4: Пептиди, протеини и мешавини на протеини Име Спецификација, каталог бр. Производител Лакпродан Алфа-10 (изолат на протеин од сурутка) 45,1% α-лакталбумин 45,9% β-лактоглобулин ARLA Foods Состојки амба, Виби, Данска Аспартилилин 94,30% синтеза на д-р. М. Хелвиг, ТУ Дрезден Глутамилглицин G1970 Бахом лизозим од јајце-бело кокошка (HEWL)
70 000-96 500 У/мг, 62971 Сигма-Олдрих, А-лакталбумин на Стејнхајм
85% изолација од изолат на протеин од сурутка (Поглавје 3.4) α-лакталбумин од говедско млеко> 85% Сигма-Олдрих, Штајнхајм β-казеин до Ашафенбург (1963) Изолација од страна на Др. C. Partschefeld, ТУ Дрезден β-лактоглобулин од говедско млеко
90% (СТРАНИЦА) Сигма-Олдрих, Штајнхајм Табела 3-5: Микроорганизми од колекција на соеви на Allgemeine Biochemie, Technische Universität Dresden Спецификација на името Боење според грамско потекло Bacillus sphaericus - грам-позитивен примерок на почва Дегуса (Антверпен) коли ТГ 1 грам негативен не е познат Pseudomonas putida ATCC 17390 грам негативен Институт за микробиологија, Универзитет во Хоенхајм Streptococcus lactis B 23/2/1 грам не е познат 3.1.4 Табела за софтвер 3-6: Користен софтвер Апликација за анализа на аминокиселини (ASA) Електрофореза (SDS-PAGE) Мерење на флуоресценција (анализа на ThT, ANS) Монтажа на крива хроматографија на гел (ГПЦ), УВ спектри (ЦД) Масовна спектроскопија (ESI-TOF-MS) Програма за хидрофобност на површина (ANS) Површинска програма Chromstar 6.3, SCPA GmbH Totallab TL 120 v2006c, Wincats, USA FL Solutions, Hitachi УВ/ВИС спектри (Конго црвено) Aspect Plus 1.7 (1993-2000) Eurochrom 2000, верзија 2.05, Кнауер, Geräteechnik Berlin J-700 за прозорец Стандардна анализа, верзија 1.35.01, ЈАСКО Корп. и CDPro, методот КОНТИН Превземање на податоци потпомогнати преку компјутер со помош на ChemStation за LC 3D, Agilent Technologies, Explorer Data Evaluation Explorer Version 4.0.0.1, Applied Biosystems, Foster City, USA Tecan i-control TM 33
3 Експериментален дел Табела 3-9: Концентрациона серија за раствори за калибрација Концентрација Л-глутаминска киселина-γхидроксамат [мм] Резервен раствор за калибрација [μl] Тфер-ацетат пуфер [μl] УВ апсорпција λ = 525 nm 2,5 1000 0 0,742 2,0 800 200 0,578 1,5 600 400 0,441 1,0 400 600 0,295 0,5 200 800 0,146 празна вредност 0 1000 - За растворот на мтгаза (40 U мтгаза/100 ml) приближно 50 mg мтгаза во 10 ml 0,2 M Tris - Растворен пуфер во ацетат. Калибрација 1 ml раствор за калибрација се меша со 1 ml реагенс за стоп и се мери со празната вредност на бранова должина од λ = 525 nm (Слика 3-2). Секогаш се спроведуваше двојно определување. Слика 3-2: Линија за калибрација: Зависност на УВ-апсорпцијата на λ = 525 nm од концентрацијата на L-глутаминска киселина-γ-хидроксамат 40
3 Експериментален дел Фотометриско определување 50 μl од воден раствор на примерок се пипетираа со 950 μl NaOH во Епендорф цевка и се мешаа со 500 μl раствор на Лоури. По 10 минути инкубација на собна температура, беа додадени 500 μl фолин реагенс и растворите беа хомогенизирани. Апсорпцијата беше измерена по 2 часа инкубација на 660 nm во спектрофотометарот Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech, Freiburg). Линијата за калибрација е создадена под исти услови со концентрација од 20 до 600 µg протеин/ml (Табела 3-10 и Слика 3-3). Табела 3-10: Шема за пипетирање за калибрација за одредување на протеини според Lowry HEWL концентрација [μg/ml] раствор на HEWL [μl] NaOH [μl] апсорпција на УВ λ = 660 nm празна вредност - 1000 0 20 20 980 0.066 ± 0.003 50 50 950 0,136 ± 0,015 100 100 900 0,250 ± 0,005 300 300 700 0,684 ± 0,060 400 400 600 0,827 ± 0,026 600 600 400 1,146 ± 0,032 Пример 50 * 950 - * 50µl од растворот на примерокот одговара на разредување од 1:20 врз основа на волуменот на тестот Калибрација Слика 3 -3: линија за калибрација, зависност на УВ-апсорпцијата на λ = 660 nm од концентрацијата на HEWL [μg/ml] 43
3 Експериментален дел Табела 3-15: Програма за одвојување за одредување на аминокиселини, систем на литиум Време [мин] Тампон 1 Буфер 2 Буфер 3 Буфер 4 Температура на печка во колона [C] 0 85 15 0 0 42 3 85 15 0 0 42 4 79 21 0 0 42 21 43 57 0 0 42 25 43 57 0 0 42 33 0 0 100 0 39 0 0 0 100 40 60 43 0 0 68 32 46 74 63 0 0 68 32 74 Идентификација и квантификација на фабриката за изопептиди: Фармација ЛКБ Алфа Плус Колона: Химатографска колона за катјонска размена 190 x 4,6 mm PEEK со смола 7 µm со 11% вкрстено поврзување Примерок пуфер: Натриум цитрат 0,2 N, ph 2,20 Волумен на инјектирање: 20-100 μl Елуенти: види Табела 3-16 Тек: 20 ml/h Програма за елуирање: видете Табела 3-17 Откривање: Дериватизација по колоната со нинхидрин, температура на серпентина 135 C, мерење: 570 nm реагенс на нинхидрин: Сикам, Фирстенфелдбрук Проток на реагенс на нинхидрин: 0,18 ml/min Проценка: Chromstar 6,3 Табела 3-16: Користени пуфери Натриумски систем за определување на Asp_Lys и Glu_Lys тампон состав моларитет pH примерок пуфер натриум цитрат 0,2 2,20 1 натриум цитрат 0,2 3,16 2 натриум цитрат 0,2 4,03 3 натриум цитрат со натриум хлорид 1,2 6,14 4 натриум хидроксид 0,4 48
3 Мерење на параметрите на експерименталниот дел: Режим на скенирање: Режим на податоци: EX WL: ЕМ Почеток WL: ЕМ завршен WL: Брзина на скенирање: Доцнење: EX процеп: ЕМ процеп: PMT Напон: Одговор: Флуоресценција на емисија на скенирање со должина на бранова должина на бран nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s калибрација Слика 3-4: Мерење на флуоресценција на калибрација на ANS анализата со 1900 μl ANS раствор (250 μm) и 100 μl примерок, λ ex = 370 nm и λ em = 480 nm, нетретиран HEWL во споредба со HEWL по фибрилација за 96 часа (според Ванг и сор., 2009b) во различни концентрации, исправена вредност. Малото зголемување на сигналот кога се зголеми концентрацијата на нетретираниот HEWL се заснова на фактот дека реагенсот беа достапни малку повеќе хидрофобни места за врзување. Во присуство на фибрилиран HEWL, сепак, беше откриено значително посилно, линеарно зголемување (Слика 3-4). 3.7.9.2 Анализа на црвена боја во Конго Овој тест базиран на УВ/ВИС детектира зголемување на апсорпцијата на црвен раствор на Конго на 540 nm во присуство на амилоидни фибрили (Ванг и сор., 2009а). 58
3 Експериментален дел 100 микрометарски раствор на тиофлавин-Т е подготвен од 1,6 mg тиофлавин Т (ThT) во 50 ml PBS пуфер. Резервниот раствор потоа се разреди 1:10 (v/v) со PBS пуфер со цел да се добие 10 μm ThT раствор. Имплементација 80 μl раствор на примерок од јачина од 0,05% (v/v) беа измешани со 1920 μl раствор на ThT, хомогенизиран и користен директно за мерење на флуоресценција. Со бранова должина на возбуда од 440 nm, евидентиран е спектарот на емисии од 450 до 530 nm на спектрофотометарот на флуоресценција F-4500. За математичка проценка беше искористен интензитетот на флуоресценција на 485 nm.За да се одреди празната вредност, беше додаден солен раствор (pH 2,2, видете 3.3) наместо 80 μl раствор на примерок. Параметри на мерењето: Режим на скенирање: Режим на податоци: EX WL: EM Почеток WL: EM крај на WL: Брзина на скенирање: Одложување: EX процеп: ЕМ процеп: PMT Напон: Одговор: Флуоресценција на емисија на скенирање со должина на бран 440 nm 450 nm 530 nm 6 nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V калибрација 0,01 s Слика 3-6: Калибрација на анализата ThT со 1920 μl ThT раствор (10 μm) и 80 μl примерок, λ ex = 440 nm и λ em = 485 nm, Нетретиран HEWL во споредба со HEWL по фибрилација за 96 часа (според Ванг и сор., 2009b) во различни концентрации, празната вредност е коригирана 60
4 Резултати и дискусија за вкрстено поврзување, тампоните од 50 мм беа најдобри, со тримери во бифе-Трис пуферот и траги на тетрамери во системот Трис. Исто така, може да се замисли дека малку зголемениот пад на pH забележан во 50мм тампонот Tris-HCl е прва индикација за добро вкрстено поврзување. Причината за намалувањето на pH вредноста како последица на вкрстеното поврзување беше фактот дека некои основни остатоци од аминокиселини веќе не беа достапни за растворувачите по формирањето на изопептидната врска. Дискусија за вклучените остатоци на лизин и глутамин и нивната околина следува во Поглавје 4.2.3. Врз основа на резултатите од различните тампонски системи, може да се открие највисоко вкрстено поврзување на HEWL со мтгаза за тампонот 50 mm-tris-hcl-па затоа е избран. Ова значеше дека pH вредностите од 7,2 до 9,0 генерално може да се постигнат со Tris-базирани тампон системи, бидејќи споменатиот тампон е стабилен во рамките на овие граници (Good et al., 1966). Понатаму, избраната ph вредност треба да биде соодветна за предвидените експерименти. Лизозимот има изоелектрична точка (pi) на
37,5 мин) и метионин (Мет, Р т
43 мин) скоро основните линии беа откриени одделно. Во родниот ХЕВЛ има 78 во овој момент
4 Резултати и дискусија Слика 4-10: RP-HPLC на триптички варениот HEWL: А - нетретиран HEWL; Б - HEWL третиран со мтгаза 30 мин на 40 C и атмосферски притисок; C - HEWL со мтгаза за 30 мин на 40 C и 600 MPa (LMW) Табела 4-8: Идентификација на триптичните пептиди од природниот HEWL со RP-HPLC со ESI-TOF-MS Врвно време [мин] m/z триптик [M + H] + [M + 2H] 2+ пептиди Теоретска маса на пептид 1 5,1 517,3-69-73 516,27 2 10,3 448,3-126-129 447,23 3 12,8 606,4- 1-5 605.36 4 13.0 874.5 437.7 15-21 873.41 5 13.5 776.4-117-123 775.35 6 14.5 1428.9 714.9 34-45 1427 .64 7 14.7 836.5-6-13 835.39 8 15.1 992.7 496 .8 6-14 991.49 9 16.5 1045.7 523.3 117-125 1044.53 10 16,9 936,5 468,7 62-68 935,37 11 17,0 1276,7 638,9 115-125 1275,64 12 17,4 1754,6 877,5 46-61 1752,83 13 19, 3 1268.7 634.9 22-33 1267.60 14 19.8 1805.1 902.6 97-112 1802.89 15 20.3 1676.4 838.5 98-112 1674.79 15 20.6 1676, 4.838.5 98-112 1674.79 I 15.7 497.3 Непознат артефакт II 17.75 1288.9 Непознат артефакт Моделите на пептиди, кои беа откриени на бранова должина од 220 nm, не покажаа разлики за природниот лизозим (Слика 4-10 А) и ХЕВЛ со мтгаза 30 мин 40 C под атмосферски притисок или висок хидростатички притисок (Слика 4-10 Б и Ц). Ова укажува дека 81 користел за лекување на HEWL
4 Резултати и дискусија A 1202,2 m/z B 817,5 m/z C 1364,9 m/z 84
4 Резултати и дискусија D 1010,7 m/z E 1507,0 m/z F 1017,7 m/z Слика 4-12: Спектри на масата на шесте идентификувани изопептидни секвенци (A - F) по триптично варење во различно време на задржување (види табела 4-9, третирани со мтгаза 30 мин на 600 MPa и 40 или 60 C) и нивните фрагменти од изопептид (броевите се однесуваат на позициите на АА во низата HEWL) 85
4 Резултати и дискусија за половина од нетретираниот HEWL. Зголемениот степен на вкрстено поврзување го одложува формирањето на јадра (рамен пораст) од една страна и растот на фибрилите (мала максимална вредност) од друга страна. Истражувањата за потенцијалот на фибрилација ги потврдуваат претходно изразените очекувања на втората теорија (Johnонсон и сор., 2005 и Бут и сор., 1997) за инхибирана склоност кон фибрилација. ABC Слика 4-33: Резултати од ANS, Конго црвена и ThT анализа (A - C) со нетретиран и вкрстено поврзан HEWL (LMW - 2% HEWL, 40 U мтгаза/g протеин на 40 C, степен на вкрстено поврзување: 8,5% и HMW - 3% HEWL, 160 U мтгаза/g протеин на 60 C, степен на вкрстено поврзување: 65%) по инкубација на pH 2,2, 55 C за 96 часа. Покрај мерењата прикажани со различни системи за бои, исто така беше можно визуелно да се утврди дека HEWL е во малку вкрстено поврзана состојба (LMW) преципитира во фин, облачен талог, додека нетретираниот HEWL формира груби агрегати (Слика 4-34). Во растворот на високо-вкрстениот HEWL (HMW), не се забележуваа врнежи во кој било момент, и покрај сигналите малку што се зголемуваат; концентрацијата на фибрил потребна за врнежи се претпоставува дека не е достигната. 119
11) може да се постигне по четири циклуси со или без вакуум. 4.6.2 Идентификација на формираните изопептиди По успешното термичко вкрстено поврзување со и без употреба на вакуум (ZLCL), треба да се разјасни прашањето за вклучените изопептиди. Како што веќе споменавме, теоретски може да се појават два различни дипептиди (Симонс и сор., 2002). Од лизин (Lys) и 145