Генерирање на мутанти за бришење на гени во рамките во Pseudomonas aeruginosa и тестирање за вирулентност

Резиме

Овде опишуваме едноставен и репродуциран протокол на глувцискиот модел на инфекција за да се процени слабеењето на генетски модифицираните соеви на Pseudomonas aeruginosa во споредба со одобрената ешерихија коли за комерцијална употреба од страна на Соединетите држави за храна и лекови (FDA).

Апстракт

Вовед

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Пред да започнете експерименти со животни, протоколот што треба да се користи мора да биде одобрен од Институционалниот комитет за грижа и употреба на животни (IACUC). Одобрението за опишаниот протокол е добиено од IACUC на Универзитетот Маршал (Хантингтон, ВВ, САД).

  1. За да создадете генетско бришење користејќи го плазмидот pEX100T-NotI, клонирајте ги регионите на ДНК кои ја придружуваат посакуваната секвенца на бришење и вметнете ги во местото за ограничување на NotI на плазмидот. Вметнувањето на плазмид треба да содржи околу 500 нуклеотиди пред целната низа, кои се непосредно соседни на околу 500 нуклеотиди по низата за бришење на целта. Покрај тоа, влошката треба да ја содржи низата за препознавање NotI (GCGGCCGC) на нејзините 5 'и 3' краја (Слика 1Б.).

  1. Опција 1: користете традиционални техники на клонирање. Користете PCR за да ги засилите геномските региони пред и по генот од интерес, проследено со кросовер PCR 9, 10 за да ги споите генерираните фрагменти, ограничување на варењето на ендонуклеазата на производот на ПЦР и плазмидот и лигатурата 11 (Слика 1Б, Ц.).
  2. Опција 2: Откако ќе ја дизајнирате низата за бришење во силициум, толерирајте компанија што синтетизира де ново да го вметне во плазмидот pEX100T-NotI. Многу компании го насочија процесот на клонирање за брзо и ефикасно генерирање на плазмидот од интерес. Покрај тоа, секвенците проверуваат дали плазмидите се без мутација пред породувањето.

  1. Трансформирајте го електрокомпетентниот E. coli со плазмидот според препораките на производителот. Користејќи стерилна јамка за инокулација, ставете 10 l од реакцијата на трансформација за изолирани колонии на загреаната плоча на агар од супа Лурија (LB), додадена со 100 g/ml карбеницилин и инкубирајте ја преку ноќ на 37 ° C.
    ЗАБЕЛЕШКА: Со целата опрема и медиуми што се користат за култивирање на бактерии треба да се постапува според упатствата за институционална безбедност.
  2. Поминете двапати.
    1. Отстранете ја плочата од инкубаторот и идентификувајте изолирана колонија. Користејќи стерилна јамка за инокулација, подигнете ја колонијата и извадете ја загреаната плоча со агар ЛБ дополнета со 100 g/ml карбеницилин за изолирани колонии. Инкубирајте преку ноќ на 37 ° С. Повторете го овој чекор повторно за да генерирате чиста култура.
  3. Користете стерилна јамка за инокулација, инокулирајте 5 ml LB со единечна колонија од последната плоча со агар. Ставете ја културата во инкубатор за тресење на 37 ° C преку ноќ. Следниот ден, измешајте 1 ml од оваа култура со 1 ml од 5% во криовијална и чувајте на -80 ° C за да создадете замрзнат фонд од сортата.

4. Подготовка на бактериска дистензија и трипарентална конјугација

5. Откривање на рекомбинанти на единечен кросовер на P. aeruginosa

6. Откривање на P. aeruginosa двојно над рекомбинантите

  1. За секоја култура на супа, инокулирајте 10 L култура на претходно загреана ПИА плоча, дополнета со 10% сахароза (без глицерол) и ленти за изолирани колонии. Инкубирајте ги плочите преку ноќ на 37 ° C.
  2. Следниот ден, извадете ги плочите од инкубаторот и испитајте дали има раст. Колониите отпорни на сахароза треба да бидат двојни вкрстени рекомбинанти (т.е. го отстраниле плазмидот од хромозомот преку настан на рекомбинација помеѓу другиот хомолог регион на плазмидната влошка и хромозомот P. aeruginosa.
    1. Отворете најмалку 20 колонии со стерилни чепкалки за загревање на загреани плочи од: 1) PIA, 2) PIA дополнета со 10% сахароза (без глицерин) и 3) PIA дополнета со 300 g/ml карбеницилин.
  3. Инкубирајте ги плочите преку ноќ на 37 ° C.
  4. Отстранете ги плочите од инкубаторот и испитајте ги за раст. Вистинските двојни кросовер-рекомбинанти ќе бидат чувствителни на карбеницилин и отпорни на сахароза (т.е. колонии кои пораснале на ПИА и ПИА дополнети со сахароза, но не пораснале на ПИА дополнети со карбеницилин).

7. Потврда за бришење на гени преку PCR на колонија

8. Подгответе бактериски вид за тестирање врз животни

VE2 и PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC

  • Инкубирајте ги културите во инкубатор за тресење на 160 вртежи во минута и 37 ° C додека не достигнат раст на лог-фаза (т.е. мерење на OD600 од 0,4-0,6 на спектрофотометар).
  • Користејќи го OD600 добиен од Фазата на најавување, постигната, пресметајте го потребниот волумен на супа за да дадете 2,5 x 10 9 единици за сликање во колонија (CFU) по ml. Пелетирајте го волуменот на супа во цевки од 50 ml на 4.500 x g за 10 мин.
  • Отфрлете го супернатантот и заменете го топчето во цевка со 50 ml 1x PBS за миење на клетките. Центрифугирајте повторно со 4.500 x g за 10 мин.
  • Отфрлете го супернатантот и повторно суспендирајте го пелетот во 25 ml 5% обезмастено млеко во 1x PBS.
    1. Чекор на валидација: Користете примерок од 25 ml ресуспензија за да извршите одржливо броење на плочи за да го одредите бројот на CFU/ml.
  • Намалете ја повторната суспензија на културата на обезмастено млеко од 25 ml во залихи на култури од 2 ml во кривови од 2 ml. Замрзнете блиц во течен азот и чувајте го на -80 ° C барем преку ноќ пред употреба.

    • 9. Валидација на залихите за раст и вирус што ќе бидат заштедени за тестирање на животни.

    1. За секоја сорта што треба да се тестира, отстранете најмалку 3 криовијали од замрзнатите резерви од складирање од -80 ° C и одмрзнете на 4 ° C за 2-4 часа. Ако ви остане замрзнат снабдување, кратко загревајте на 37 ° C.
    2. Земете мали примероци од секој криовијален за да ја потврдите секоја сорта.
      1. Изведете изводливо броење на плочи за да го одредите бројот на CFU/mL. Нормално е да имате помалку CFU/ml после замрзнување поради смрт на некои бактериски клетки.
      2. Користете PCR и буквари специфични за истегнување за да го потврдите секој вид.
      3. Повлечете го секој отпечаток на селективен медиум за да се потврди фенотипот.
    3. Откако потврдивте дека соевите се точни генотип и фенотип и го потврдите CFU/ml, преминете на испитување на животни.

    10. Вакцинација на животни со бактериски соеви со инјекција

    11. Статистичка анализа на смртност кај животни

    12. Визуелизирајте ја инфекцијата со биолуминисценција

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    Како на слика 2Како што е прикажано, целното геномско бришење може да се потврди со употреба на PCR во колонија со специфични прајмери ​​кои го подобруваат регионот на интерес. Колониите што носат геномско бришење резултираат во пократка големина на PCR опсегот во споредба со колониите од див тип. PCR-екранот од 10-12 колонии е обично доволен за откривање на барем една колонија која носи насочено бришење. Ако бришењата не се детектираат по неколку круга на екранот, повторете го процесот што започнува со конјугација. Ако бришењето сепак не успее, распоредувањето на плазмидот можеби ќе треба да се потврди со секвенционирање, редизајн или фатална низа. Откако ќе потврдите бришење на ген преку PCR, потврдете го бришењето со секвенционирање. Резултирачкиот вид може постојано да биде подложен на процесот за да се произведат последователни геномски модификации.

    Како на слика 3како што е прикажано, смртноста поврзана со интраперитонеална инјекција на ослабениот вид на P. aeruginosa PGN5 (+ мукуе) беше 0%, што беше иста како онаа забележана кај E. coli BL21. Од друга страна, интраперитонеалната инјекција на матичниот вид (VE2) беше фатална за 80% од глувците. Овие резултати беа постигнати со обемни чекори за потврдување на инјектираните соеви. Додека точната причина за смртта кај овие глувци е непозната, таа може да се пронајде, барем делумно, до изразувањето на факторите на вирулентност кај матичниот вид кои биле избришани од ослабениот сој PGN5. Разликите во прогресијата на инфекцијата беа проследени со родители обележани со биолуминисценција и ослабени соеви. Ослабеното стебло остана локализирано на местото на инјектирање сè додека не исчезна биолуминисценцијата (Слика 4)) Расчистувањето на инфекцијата најверојатно се совпадна со бледнењето на биолуминисценцијата. Биолуминисценцијата не е откриена 24 часа по инјекцијата и глувците живееле со недели по инјекцијата, сè додека не биле жртвувани, а не биле забележани несакани ефекти.

    генерирање
    Слика 2: Гел електрофореза на колонистички PCR производи од екранот за бришење aroA за да се генерира ослабениот P. aeruginosa, PGN5. Колониските производи со PCR кои сообраќаат по лентите 2-5 и 8-11 покажуваат колонии со ароА од див тип. Колониските производи на PCR кои се движат во лентите 6 и 7 носат бришење на генот во ерата, што е означено со помалиот производ на PCR (жолт sterвездичка). Употребените буквари специфично ја зајакнаа геномската област што го содржи генот aroA: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGAGU и aroA-R: ATCTGGCTCGCTCTGCCGGTCC. Очекуваната големина на производот на PCR во дивите колонии беше 2548 нуклеотиди (нт). Очекуваната големина на производот на PCR во колонии со бришење aroA беше 307 nt. ДНК-скалата беше пренесена во лентите 1 и 12. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

    генерирање
    Слика 3: Севкупна смртност на глувци заразени со патогени сорти на P. aeruginosa (VE2), ослабен P. aeruginosa (PGN5 + mucE) и FDA контрола Е. коли вирус (BL21). Само глувците инјектирани со патогени матични материи имале смртност од 80%. Атенуиран сој на P. aeruginosa и контрола на ФДА Е. коли вирусот имаше смртност од 0%. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

    гени
    Слика 4: Слика на глувчето 3 часа по инјектирање на ослабен сој на P. aeruginosa PGN5 + mucE со биолуминисцентен маркер. Биолуминисцентните бактерии може да се забележат до 18-24 часа по инјекцијата. За тоа време, биолуминисценцијата остана на местото на инјектирање, што сугерира дека бактериите остануваат локализирани на местото на инјектирање. Ова глувче целосно се опорави без негативни ефекти. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Плазмидот pEX100T-Not1 е ефикасен медијатор на секвенцијални геномски бришења што се без обележувачи и во рамка. Кога се развиваат соеви на бактерии за атенуирана вирулентност, бришењето на целата генска низа наместо генерирањето на мутациони точки ја намалува веројатноста за враќање на вирулентен фенотип. Покрај тоа, секое бришење на гени за патогеност дополнително го потиснува патогенот и ја зголемува стабилноста на амортизацијата.

    Овој метод може да се искористи и за создавање на геномски модификации, освен бришење, како што се точки мутации и вметнувања, едноставно со промена на дизајнот на плазмидната влошка. Овие типови модификации можат да бидат покорисни од бришењата на целиот ген за технички бактерии со модифициран метаболизам, на пример. Секвенцијалната геномска модификација има значителен потенцијал за генерирање на дизајнерски соеви на бактерии за специфични цели во истражувањето и индустријата. Опишани се други методи за генерирање на посакувани геномски модификации без маркери кај бактериите 15, 16, 17, 18. Како и со сите методи на уредување на геном, обидите за модификација на основните геномски региони можат да бидат фатални и затоа да бидат неуспешни. Во овие случаи, потребна е идентификација на разни генетски модификации или други кандидати гени со цел да се генерира бактерискиот вид на интерес.

    Со оглед на бројните репликации и пасуси на секоја колонија во овој протокол, ќе има несакани промени во геномот на произведената сорта. Точните геномски промени може да се идентификуваат со секвенционирање на целиот геном. Сепак, потешкотиите да се утврдат ефектите од овие промени. Кога се развиваат бактерии за одредена цел, геномските промени што не влијаат негативно на растот на организмот или целните патишта се толерантни. Во зависност од генерираниот вид, може да биде можно да се идентификува „читање“ за да се осигура дека сортата продолжува да биде корисна за намената. На пример, со PGN5 целта беше да се создаде ослабен сој што ја задржува способноста да произведува големи количини на алгинат. По бришење на пет гени на патогеност, измерената е количината и составот на алгинат произведен од PGN5 и се покажа дека е споредлив со другите соеви што произведуваат алгинат. На производството на алгинат не влијаеле петте бришење гени или несаканите геномски промени што се случиле за време на развојот на PGN5.

    Употребата на биолуминисценција како маркер овозможува дополнително валидирање на инјектираните бактериски соеви, бидејќи маркерот може да се визуелизира на местото на инјектирање. Вметнување на биолуминисцентен маркер во бактерискиот хромозом е потребно за биолуминисцентно снимање, но може да не е можно кога работите со некомпатибилни соеви/видови. Сепак, не е потребно обележување на соединенија со биолуминисценција за да се испита слабеењето. Видовите тестирани во оваа студија беа обележани со биолуминисценција, што овозможи визуелизација на разликите во локализацијата помеѓу соевите во текот на инфекцијата. Забележавме дека патогениот вид се шири низ телото на глувчето, но непатогениот вид останува на местото на инјектирање. Додека овој експеримент тестирал само два многу тесно поврзани сорта на P. aeruginosage, тој сугерира дека ширењето на бактериите е поврзано со вирулентност, барем во P. aeruginosa. Овој метод на обележување со биолуминисценција може да се користи во иднина за да се визуелизира прогресијата на инфекцијата со цел брзо да се процени слабеењето на техничките бактериски соеви.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Откривање

    Авторот, Хонгвеи Д. Ју е главен научен директор и ко-основач на Прогенезис технолоџи, ДОО.