Гломеруларен израсток како Ex Vivo анализа за анализа на патиштата вклучени во париеталната епителна клетка

Резиме

Оваа статија опишува метод за култивирање и анализирање на гломеруларни париетални епителни клетки израстоци од капсулирани гломерули изолирани од бубрегот на глувчето. Овој метод може да се користи за проучување на патиштата вклучени во пролиферацијата и миграцијата на париеталните епителни клетки.

Апстракт

Вовед

Гломеруларните заболувања се важна група на болести на бубрезите и се водечка причина за крајна фаза на бубрежни заболувања (ESRD). За жал, специфичните опции за третман се ограничени, а преминот кон ESRD е неизбежен. Гломеруларните болести се дефинираат со присуство на гломеруларни повреди и можат да бидат групирани во воспалителни и невоспалителни болести. Иако првичната навреда е различна, неодамнешните студии покажаа дека заеднички клеточен механизам доведува до хиперплазија на гломеруларни епителни клетки и на крајот до гломерулосклероза кај сите гломеруларни заболувања, без оглед на основната причина 1, 2, 3, 4 .

Особено, се покажа дека гломерулосклеротичните лезии главно се состојат од активирани париетални епителни клетки 5, 6. Под физиолошки услови, париеталните епителни клетки се рамни, заспани епителни клетки кои се поставени на гломерусот во капсулата на Бауман. Сепак, каква било гломеруларна повреда, или како резултат на генетски мутации (на пример, специфични за подоцити или митохондријални цитопатии), воспаление или хиперфилтрација (на пример, предизвикана од намалена бубрежна маса, висок крвен притисок, дебелина или дијабетичен мелитус) може да предизвика активирање на париеталните епителни клетки . Активираните париетални епителни клетки се размножуваат и депонираат екстрацелуларна матрица, што доведува до формирање на клеточни полумесечини или склеротични лезии 5, 7, 8. Прогресијата на овие процеси доведува до губење на функцијата на бубрезите 9. Затоа, активирањето на активацијата на париеталните епителни клетки е клучен фактор во развојот и прогресијата на гломерулосклерозата кај воспалителни и неинфламаторни гломеруларни заболувања 1, 2, 3, 4, 10 .

Молекуларните процеси кои посредуваат во активирањето на париеталните епителни клетки сè уште се непознати. Неодамнешните студии покажуваат дека активираните париетални епителни клетки de novo EXPRESS CD44, рецептор кој е вклучен во активирање на разни патеки во пролиферацијата и миграцијата на клетките. Покрај тоа, докажано е дека инхибицијата на ЦД44 ја инхибира активирањето на активацијата на париеталните епителни клетки и ја ослабува прогресијата на формирањето на полумесечина и гломерулосклерозата кај животинските модели на воспалителни и неинфламаторни гломеруларни заболувања 11, 12.

Бидејќи активирањето на париеталните епителни клетки е важен играч во развојот на гломерулосклероза и формирање на полумесечина, инхибицијата на овие клетки може да го забави прогресијата на гломеруларните заболувања. Разјаснувањето на молекуларните патеки кои управуваат со активирање на париеталните епителни клетки може да доведе до развој на специфични терапевтски интервенции кои го ослабуваат формирањето на хиперпластични и гломерулоклеротични лезии кај гломеруларни заболувања.

Кај експерименталните животински модели, често е тешко да се обезбедат докази за директен ефект на изменета генска експресија (нокаут модели или модели на трансгени глувци) или третман со лекови врз париеталните епителни клетки. Во конвенционален нокаут-глушец, забележаните ин виво промени може да се објаснат со директни промени во париеталните епителни клетки. Сепак, бидејќи изразот на гени е променет и кај другите типови на клетки во рамките на глувчето, индиректните ефекти што се посредуваат од другите типови на клетки не можат да се исклучат. Развојот на условните глувци Cre-Lox управувани од промотори кои се првенствено активни во париеталните епителни клетки обезбеди решение за 13 во некои случаи. Сепак, условните трансгенски модели се сложени и додека стануваат достапни повеќе условни линии, многу од традиционалните линии на нокаут или трансгени глувци сè уште не се условно заменети.

За да ги проучиме директните ефекти врз париеталните епителни клетки, нашата група разви ex vivo анализа користејќи единечни капсулирани гломерули изолирани од бубрезите на глувчето за да се измери и анализира пролиферацијата и миграцијата на париеталните епителни клетки. Овој метод ќе ни овозможи да ги утврдиме ефектите специфични за париеталните епителни клетки и да најдеме одговорни патишта за активирање на париеталните епителни клетки и да ги тестираме опциите за третман за да ја инхибираме оваа активација.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Сите експерименти врз животни беа спроведени во согласност со упатствата на Комитетот за етика на животните на Универзитетот Радбуд Нијмеген.

ЗАБЕЛЕШКА: Нетретирани, здрави глувци од див тип (n = 4) и cd44 -/- (n = 4) глувци биле жртвувани на возраст од 12 до 16 недели. Користени се и машки и женски глувци. Сите глувци беа на позадината C57Bl/6.

1. Sртвувајте здрави глувци WT или генетски модифицирани глувци со дислокација на грлото на матката.
2. Расечете ги бубрезите од целиот глушец веднаш по жртвувањето на глувците. За да го направите ова, направете средна лапаротомија со абдоминални ножици, исечете ја кожата, а потоа и стомачните мускули. Отстранете го цревото и ставете го покрај глувчето.
3. Ослободете ги бубрезите од спојување на ткивата и извлечете го бубрегот со хируршки клешти, исечете ја бубрежната артерија, бубрежната вена и уретерот со ножици.
4. Отстранете ги капсулите на бубрезите од бубрезите држејќи го бубрегот со хируршка форцепс и излупете ја капсулата со друг пар форцепс.
5. Подгответе ги бубрезите во плоча со клеточна култура од 6 бунари (2 бубрези/бунар) со 2 ml раствор на сол на Вон Хенкс (HBSS) по бунар и ставете го на мраз.

2. Изолација на гломерули од бубрег на глувче

3. Одгледување на гломеруларен израсток

4. Анализа на пролиферација на париеталните епителни клетки

5. Карактеризација на растот на гломеруларните клетки

ЗАБЕЛЕШКА: За да се процени клеточниот состав на израстокот, се прави боење со имунофлуоресценција за специфични клеточни маркери на гломеруларните израстоци на t = 6 дена.

1. Внимателно отстранете ја средината и нежно измијте ги гломерулите двапати со солен раствор на фосфат (PBS).
2. Поправете 10 мин на собна температура со 2% (без напон) параформалдехид (PFA) дополнет со 4% (w/v) сахароза во PBS и внимателно измијте 2x со PBS.
3. Со примарното антитело во соодветна концентрација (Табела со материјали) Инкубирајте во PBS-Ovine серумски албумин (BSA) разреден 1% (v/v) 1 час на собна температура.
4. Извадете го растворот на антитела и внимателно измијте 3х со PBS.
5. Инкубирајте со секундарно антитело (Табела со материјали) разредена во PBS-BSA 1% (v/v) во темница 45 мин на собна температура.
6. Внимателно измијте 3х со PBS и склопете се со 1-2 капки воден склопувачки медиум со 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) со цел да се визуелизираат јадрата и да се покрие бунарот со кружен лизгач на капакот.
7. Направете микроскопски слики со флуоресцентен микроскоп.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Слика 1: Шематски преглед на методот за изведување на гломеруларна анализа на израсток за анализа на пролиферацијата на епителните клетки. (1) Бубрезите се расчленуваат од жртвуваниот глушец и се мелат на мали парчиња. (2) Бубрежното ткиво се форсира низ сито од 300 м и се исплакнува низ сито од 75 и 53 м. (3) Гломерулите што останаа на ситото се собираат со медиум + 20% (v/v) FCS и се пренесуваат во ултра-ниска плоча за монтирање. (4) Индивидуалните гломерули се собираат со превртен светлосен микроскоп и се пренесуваат во плочи со култури од 24 бунари. (5) По инкубација на 37 ° C, 5% (v/v) CO2 за 6 дена, гломеруларниот израсток може да се анализира со дигитален микроскоп со превртена светлина. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

Слика 2: Гломеруларен израсток на изолирани капсулирани гломерули од бубрези расечени од глувци со WT. Растот на капсулирани гломерули инкубирани на 37 ° C е индициран во различно време: (А.) 0 дена, (Б.) 2 дена, (Ц.) 4 дена и (Д.) 6 дена. Декапитулираните гломерули исто така беа изолирани и култивирани на 37 ° C, а микроскопските слики беа земени наДен0 и (Ф.) Ден 6 што не покажа растечки клетки. Скала лента: (А, Е, Ф.) 200 мин., (Б.) 400 мин., (ЦД) 1000 м. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

Слика 3: Растечките гломеруларни клетки го покажуваат изразот на маркерот на париеталниот епител. Боењето со имунофлуоресценција беше извршено на 6-ти ден по изолацијата на одделни капсулирани гломерули со цел да се карактеризираат обрасните епителни клетки. Порастените клетки обоени позитивно за маркетни епителни клетки: (А.) ЦД44, (Б.) SSeCKS и (Ц.) клаудин-1, но не покажа израз на (Д.) синдотоподин-специфичен маркер на синопододин или (Е.) специфичен маркер за ендотелијалните клетки ЦД31, кој се наоѓал исклучиво во гломерусот. Скала лента: (А, Б, Д, Е.) 100м, (Ц.) 50 м. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

Слика 4: Гломеруларниот израсток е нарушен кај гломерулите изолирани од нокаут глувците ЦД44. Инкапсулирани гломерули се добиени од расечени бубрези од (А.) WT глувци и (Б.) cd44 -/- изолирани глувци. Микроскопските слики се направени со дигитален микроскоп со превртена светлина по 6 дена во културата. Бројот на растечки париетални епителни клетки и површината на израстокот се зголемија во гломерулите на глувци WT во споредба со глувците cd44 -/- што укажува на важна улога за CD44 во активирањето на париеталните епителни клетки. Лента за размери: 1000 м. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа слика.

Слика 5: Пример за анализа на површината на гломеруларниот израсток како маркер за пролиферација на париеталните епителни клетки со ImageJ (FIJI). (А.) Гломеруларен израсток на капсулиран гломерул на WT глушец по 6 дена во култура на 37 ° С. (Б.) Прво се одредува скалата со цел да се анализира површината во mm 2. Еве: 1 мм = 460 пиксели. (Ц.) По поставувањето на скалата, се повлекува линија за избор околу областа на гломеруларниот израсток. (Д.) Потоа, оваа избрана област може да се измери (површина во овој пример = 2.235 mm 2). Лента за размери: 1000 м. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа слика.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Протоколот опишан во овој напис може да се користи за употреба на индивидуални капсулирани гломерули за да се процени пролиферацијата на париеталните епителни клетки што е последица на активацијата на париеталните епителни клетки. Овој ex vivo модел ќе ни овозможи детално да ги проучуваме молекуларните патеки вклучени во активирањето на париеталните епителни клетки. Опишаниот метод се заснова на едноставниот концепт на бубрежна дисекција и просејување за да се изолираат и култивираат капсулирани гломерули и да се спореди пролиферацијата и/или миграцијата на париеталните епителни клетки под различни експериментални услови. Резултатите што можат да се анализираат по 6 дена во културата се, на пример, површината или дијаметарот на израстокот или бројот на растечки клетки на еден капсулиран гломерул. Друга апликација за овој тест може да биде проучување на ефектите на лекови кои предизвикуваат или инхибираат молекуларни патишта што можат да бидат вклучени во активирање на париеталните епителни клетки.

Боењето со имунофлуоресценција потврди дека клетките што растат се париетални епителни клетки по 6 дена во културата, бидејќи биле обоени позитивно за маркетите на париеталните епителни клетки (ЦД44, клаудин-1, SSeCKS), но не го изразиле ниту маркерот специфичен за подоцитите, ниту маркерот на ендотелните клетки ЦД31. Во согласност со резултатите од боењето, не може да се забележат растечки клетки 6 дена по изолацијата и културата на одделни обезглавени гломерули, што сугерира дека постои ограничена контаминација на други гломеруларни клетки во израстокот во рамките на овој период од 6 дена. Друга студија исто така го анализирала гломеруларниот израсток и покажала дека брзорастечките клетки добиени од гломеруларен израсток се всушност изведени од париеталните епителни клетки 14.

Протоколот за боење што се користи за анализа на изразот на обележувачи на клетките што растат, исто така може да се прилагоди на други молекули од интерес. Имунизацијата се спроведуваше во бунарите на плочите во кои гломерулите беа инкубирани 6 дена. Овие бунари не беа обложени во текот на првите 2-3 часа инкубација, но гломерулите беа прикачени на бунарите. Инкубацијата на стаклени влошки или систем на лизгачка комора, што би резултирало во подобро снимање, не била можна бидејќи гломерулите не биле целосно прицврстени на површината, а гломеруларниот израсток бил нарушен. Овој специфичен протокол неодамна беше воспоставен за проучување на растот на париеталните епителни клетки од гломерули од здрави WT и cd44 -/- глувци 11. Со овој метод се покажа дека ЦД44-дефицитарни париетални епителни клетки имаат намалена стапка на размножување, што е исто така прикажано на слика 4ќе бидат прикажани. Овој метод може да се користи и за глувци од други видови и исто така и за други генетски модифицирани глувци. На пример, претходната студија користела сличен пристап за да ги анализира ефектите на сигнализацијата на глукокортикоидните рецептори 15.

Употребата на оваа техника за изолирање на гломерулите од глувци и анализата на клеточните израстоци има многу предности во однос на употребата на продолжени париетални епителни клетки за анализа на патиштата вклучени во активирање на париеталните епителни клетки или лекови кои влијаат на процесот на Може да влијае на пролиферацијата на епителните клетки. Како прво, овој метод користи примарни клетки кои растат директно од гломерулот и се во културата само 6 дена. Затоа, париеталните епителни клетки од гломеруларни израстоци доживеале помалку промени во фенотипот отколку вечните клеточни линии, за кои се потребни дополнителни пасуси за раст за да се произведе клеточна линија 16. Покрај тоа, методот опишан овде може да се користи за споредување на ефектот на специфични генски нокаути врз пролиферацијата на париеталните клетки и за патеки кои е тешко да се замолчат во клеточните линии поради нарушен раст на клетките или ефикасност на GenKnockout со употреба на методи на замолчување.

За да се прилагоди протоколот на други животински модели или на човечко бубрежно ткиво, големината на ситото треба да се оптимизира за најдобар резултат. Ова е затоа што гломеруларната големина се разликува помеѓу видовите и затоа големината на ситото на која може да се соберат гломерулите варира. Исто така, важно е да се изолираат непроменети, капсулирани гломерули за целите на овој метод. Затоа, гломерулите не треба да се исцедат, туку нежно да се исплакнат низ помалите сита.

Друг важен чекор во протоколот е собирање на капсулирани гломерули по просејувањето. Тука е важно да се користи медиум со 20% FCS за да се избегне приврзување на гломерулите едни на други. Покрај тоа, растворот збогатен со гломерули треба да се пренесе директно на ултра-ниски лепливи плочи, во спротивно гломерулите ќе бидат прицврстени директно на површината на редовните плочи на клеточна култура, па дури и на површината на пластичните цевки, што го отежнува откривањето и изолирањето на одделни гломерули.

Откако ќе се соберат индивидуални капсулирани гломерули, тие треба да се култивираат 3 часа во мал волумен на културен медиум во центарот на бунарот за да се овозможи адхезија. Гломерулите не треба да лебдат во насока на линијата на табли на бунарите за да се оптимизира отчитувањето при анализата на сликата.

Со цел да се постигнат најдобри резултати со протоколот опишан овде, препорачуваме да се култивираат индивидуални гломерули и да се изврши отчитување на 6-ти ден. Во овој момент во времето, може да се забележи хомоген мобилен израсток кој се состои од париетални епителни клетки. На подоцнежните времиња, гломеруларниот израсток станува фенотипски хетероген, што укажува на раст на други типови на клетки. Затоа, протоколот се чини дека не е соодветен за многу долго време на инкубација. Треба да се напомене дека времињата на инкубација за израстоци на париеталните епителни клетки може да варираат помеѓу видовите или помеѓу различните соеви на глувци. Затоа, времињата на културата треба да бидат тестирани и оптимизирани за секој вид на глушец или вид. Покрај тоа, потеклото на гломеруларниот израсток секогаш треба да се потврдува со боење за маркери специфични за париетални епителни клетки.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

---