Хемиска ампутација и регенерација на фаринксот во планарната Schmidtea mediterranea

Резиме

Planarian Schmidtea Mediterranea е одличен модел за проучување на матични клетки и регенерација на ткивата. Оваа публикација опишува метод за селективно отстранување на орган, грлото, со изложување на животните на хемискиот натриум азид. Овој протокол ги опишува и методите за следење на регенерацијата на грлото.

Апстракт

Планарите се рамни црви кои се исклучително ефикасни во обновувањето. Оваа способност ја должат на голем број матични клетки кои можат брзо да реагираат на секаков вид повреди. Вообичаени модели на повреди кај овие животни отстрануваат големи количини на ткиво што оштетува повеќе органи. Со цел да се надмине ова широко оштетување на ткивото, опишуваме овде метод за специфично отстранување на еден орган, грлото, во планарната Schmidtea Mediterranea. Ова го постигнуваме со натопување на животни во раствор што содржи инхибитор на цитохром оксидаза натриум азид. Краткото изложување на натриум азид предизвикува истиснување на грлото на животното, она што ние го нарекуваме „хемиска ампутација“. Хемиската ампутација го отстранува целиот фаринкс и создава мала рана каде што фаринксот лежи во цревата. По широко испирање, сите ампутирани животни регенерираа целосно функционално грло за околу една недела. Матичните клетки во остатокот од телото управуваат со регенерација на новото грло. Овде даваме детален протокол за опис на хемиска ампутација и хистолошки методи на однесување за проценка на успешна ампутација и регенерација.

Вовед

Регенерацијата е феномен што се јавува низ животинското царство, со регенеративни капацитети кои се движат од регенерација на целото тело кај одредени без'рбетници до поограничени можности кај 'рбетниците 1. Замената на функционалните ткива е сложен процес и честопати повлекува истовремено враќање на повеќе типови клетки. На пример, саламандер екстремитети, остеобласти, хондроцити, нервни клетки, мускули и епителни клетки треба да се регенерираат 2 заменети. Покрај тоа, овие новосоздадени типови на клетки треба правилно да се организираат за да се олесни новата функција на екстремитетот. Разбирањето на овие сложени процеси бара техники кои се фокусираат на регенерација на специфични видови клетки и нивна интеграција во органите.

Една од стратегиите за поедноставување на проучувањето на регенеративните одговори е насочена аблација на специфични типови клетки или поголеми збирки на ткива. На пример, изразот на нитроредуказа кај одредени видови клетки кај зебрафисот доведува до нивно уништување по употребата на метронидазол 3, 4. Во ларвите на Дрософила кои аплираат изразувачки про-апоптотски гени под специфични за ткиво промотори насочени кон одредени региони на имагиналниот диск 5, 6. И двете од овие стратегии предизвикуваат брзо, но контролирано оштетување и се користени за дисекција на молекуларните и клеточните механизми одговорни за регенерација.

Во овој ракопис опишуваме метод за селективно аблатирање на цел орган наречен фаринкс во планетарната Шмидеја медитеранска. Планарите се класичен модел на регенерација, познат по нивниот плоден регенеративен капацитет, каде што и најмалите фрагменти од цели животни 7, 8 растат повторно. Тие имаат голема, хетерогена популација на матични клетки кои се состојат од плурипотентни клетки и ограничени лоза на прогенитори 9, 10, 11. Овие клетки се размножуваат и се разликуваат за да ги заменат сите исчезнати ткива, вклучително и грлото, нервниот, дигестивниот и екскреторниот систем и мускулните и епителните клетки 9, 10, 12. Знаеме дека овие матични клетки иницираат регенерација, не ги разбираме целосно молекуларните механизми што ги поттикнуваат да ги заменуваат овие различни типови на клетки. Дефинираните повредени методи кои можат да предизвикаат прецизни реакции на матични клетки помагаат да се разграничи овој сложен процес.

Фаринксот е голема, цилиндрична цевка потребна за хранење и содржи неврони, мускули, епителни и секреторни клетки 13, 29. Обично скриен во џеб на стомакот на животното, се протега над индивидуалното тело на животното за да се отвори чувствувајќи го присуството на храна. За селективно ампутирање на фаринксот, ние ги впиваме планарите во хемикалија наречена натриум азид, најчесто користен анестетик во C. elegans 14, 15, 16. Неговата употреба во планариуми е прв пат пријавена од Адлер и сор., 2014-12. За неколку минути од изложеноста на натриум азид, планарите ќе ги истиснат своите фарингети и со нежно возбудување на фаринксот ќе го одделат животното. Оваа целосна и селективна загуба на грлото е она што ние го нарекуваме „хемиска ампутација“. Една недела по ампутацијата, целосно функционалното грло е вратено на 12-то Бидејќи фаринксот е потребен за хранење, функционалната регенерација може да се мери со следење на однесувањето на хранењето. Во продолжение го опишуваме протоколот за хемиска ампутација и за проценка на регенерацијата на грлото и враќање на однесувањето на хранењето.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

3. Проценка на отстранување на фаринксот по ампутација

Испитајте ги животните под микроскоп (со зголемување од 10-20X) за да видите дали се појавила темна дамка по делектирање на грлото, како на слика 2Априкажано.
Алтернативно, поправете ги и избелувајте ги животните според протоколот на Пирсон и сор. опишан 20. Потопете ги животните преку ноќ во 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или конјугиран стрептавидин во ткивна култура (1 мг/мл разреден 1: 500, 1x раствор на фосфат со 0,3% тритон-Х). Animивотни на слајдови во 80% солен раствор на глицерол/20% 1Х фосфафефер и слика под флуоресцентен стереомикроскоп (Слика 2 б) монтирање.
Забелешка: Сите слики во овој ракопис се снимени на флуоресцентен стерео микроскоп со 1.0X цел.

4. Евалуација на регенерацијата на фаринксот со мерење на однесувањето на хранењето

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Изложеноста на натриум азид ја нарушува нормалната подвижност на планарите, предизвикувајќи животни да се протегаат и да се грчат. Овие движења го принудуваат грлото да излезе од вентралната страна на животното и по околу 6 минути во раствор на натриум азид, може да се забележи белиот врв на грлото (Слика 1 б-лево). Неколку минути подоцна, животните активно се стегаат и целосно го шират грлото принудувајќи го да излезе од телото. (Слика 1 б-Центар). Опуштете се околу 11 минути по изложувањето на азид, животните и грлото. Во оваа фаза, типичната форма на bвонче на грлото е јасно видлива (Слика 1 б-десно стакло). За едноставна ампутација, важно е да почекате фаринксот да се релаксира.

Бидејќи фаринксот е голема, непигментирана маса на ткиво, тој го отстранува појавувањето на темно место на грбната страна на ампутираното животно (Слика 2А). Овој темен регион е визуелна индикација за успешна ампутација со живи животни. Местото е видливо веднаш по ампутацијата и станува поизразено следниот ден. Бидејќи фаринксот се обновува, овој регион се олеснува. За да се следи регенерацијата на фаринксот повнимателно, животните исто така може да се обојат со DAPI или ткивни култури конјугирани со стрептавидин преку ноќ (Слика 2 б). Со цел квантитативно да се процени степенот на регенерација на грлото, неговата површина може да се измери со софтвер ImageJ.

илустрација 1 . Искашлување и ампутација на фаринксот. (А) Шематски приказ на планарна анатомија. (Б) Сликите на живи животни покажуваат фарингеален спутум по натопување во 100 мм натриум азид. Црвените стрели го обележуваат грлото. Скалирани шипки = 750 μm. (C) Слика на живи животни (лево) и дијаграм на колото (десно) на ампутацијата со пинцети. Панелите покажуваат две различни опции за фаќање на грлото. Стомакот на животното е свртен нагоре. Скалирани шипки = 500 μm. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 2 . Евалуација на ампутација и регенерација на грлото. (А) репрезентативни слики на живи животни во одредено време пред и по ампутацијата. Средната област покажува темна дамка во фаринксот по ампутација, нагласена со испрекинато бело поле. Грбната страна свртена нагоре. Скалирани шипки = 500 μm. (Б) репрезентативни слики на животни извалкани со Алекса488-стрептавидин во одредени периоди пред и по ампутацијата. Средниот панел покажува отсуство на грло по ампутацијата. Фарингеален регион означен со бела кутија. Соочувајќи се нагоре. Скала лента = 500 μm. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 3. Евалуација на регенерацијата на грлото. (А) Слики и шема на анализата за хранење извршена со поставување 25 μl црн дроб во центарот на садот Петри од 60 mm. Дијаграм на колото (горе, лево) и слика (средина) покажуваат однесување на хранење кај животни со недопрени фаринги. Горе десно, слика на животното што јадело. Дијаграм на коло (долу лево) и слика (центар) на однесувањето на хранењето кај животните 1 ден по ампутацијата. Долу десно, животно што не јадело. Скала лента = 750 μm. (Б) Резултати од анализата на хранење. Пропорција на животни кои конзумирале храна (квантифицирана со црвена боја) во одредено време по ампутацијата. За секоја временска точка, n = 10 животни, повторени во три примероци. Лента за грешки = SD Ве молиме кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Овој протокол опишува метод за селективно аблација на грлото со натриум азид. Понатамошните насочени студии за аблација кај планарите користеле модифицирана операција за отстранување на фоторецепторите 21 или фармаколошки третман за аблација на допаминергичните неврони 22. Голема предност на хемиската ампутација во однос на постојните методи е тоа што не бара хируршка интервенција. Цврстата структура на грлото во споредба со остатокот од планарното тело го олеснува неговото целосно отстранување од животното, што е многу помеко тело. Фаринксот исто така го одделува животното на мала раскрсница (хранопровод) 30, спојувајќи се со фаринксот и цревата, создавајќи повеќе рана што може да се размножува отколку што е предизвикана од поголема хируршка алатка. Поради неговите физички својства и малата анатомска врска со остатокот од животното, отстранувањето на фаринксот создава повеќе хомогени рани отколку другите хируршки ампутации.

Времетраењето на изложеноста на натриум азид е исто така клучно за успехот на оваа техника. Иако краткото изложување на натриум азид не влијае негативно на планарите, долгите временски периоди се отровни и на крајот ќе убијат животни. Познато е дека натриум азидот ги инхибира процесите зависни од енергија со инхибиција на цитохром оксидаза 23,24. Покрај тоа, таа ја потиснува транскрипцијата и преводот, веројатно преку акумулацијата на клучните компоненти на овие реакции во гранулите на стресот 25. Кај планарите, изложеноста на натриум азид ја потиснува митозата 24 часа, по што клетките ја продолжуваат пролиферацијата 12. Промени како што се Б. Ограничување на времетраењето на изложеноста на азид, елиминирање на натриум азид со темелно испирање и балансирање на заштитата од митотички пренапони во експерименталниот дизајн може да помогне во надминување на овие граници.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Откривање

Авторите не откриваат ништо.

Признанија

Би сакале да му се заблагодариме на Алехандро Санчез Алварадо, кој помогна во првичната оптимизација и развој на оваа техника. Лабораторијата Каролин Адлер е поддржана со пари од семе од универзитетот Корнел.