Хиперандрогенски модел на глувче за проучување на протоколот на синдром на полицистични јајници (во превод на германски)

Резиме

Ние го опишуваме развојот на посно глувчешки модел сличен на PCOS со користење на дихидротестостерон на пелети за проучување на патофизиологијата на PCOS и потомството од овие брани слични на PCOS.

Апстракт

Хиперандрогенемијата игра клучна улога во репродуктивната и метаболичката функција кај жените и е белег на синдромот на полицистични јајници. Развојот на тенок модел на глувче сличен на PCOS кој имитира жени со PCOS е клинички релевантен. Во овој протокол опишуваме таков модел. Со вметнување на должина на DHT (дихидротестостерон) пелети во форма на пелети во прав 4 mm (вкупната должина на пелетите е 8 mm), и замена на нив месечно, можеме да користиме модел на глушец сличен на PCOS со ниво на серумско DHT 2 пати поголемо од глувците кои не се всадени со Да се ​​произведе DHT (не DHT). Забележавме репродуктивна и метаболна дисфункција без промена на тежината или составот на телото. Додека се покажуваат високи нивоа на неплодност, мала подгрупа на овие глувци слични на PCOS може да забремени, а нивните потомци покажуваат одложен пубертет и покачени нивоа на тестостерон како возрасни. Овој тенок глушец како PCOS е корисна алатка за проучување на патофизиологијата на PCOS и потомството од овие брани слични на PCOS.

Вовед

Оваа нова парадигма (релевантни критериуми на општеството за NIH и AE-PCOS) ја моделираат болеста со производство на релативно слични нивоа на андрогени со оние на жени со PCOS 2-3 пати поголеми нивоа на тестостерон или DHT во споредба со жени кои не влијаат на тоа. Сепак, овој модел се одржува со постојан егзоген DHT, а не со програмиран ендоген хиперандрогенизам откако DHT е повлечен. Главната цел на овој напис е да се фокусира на 1) начинот на пелетирање на DHT; (2) како да генерирате Lean PCOS како модел на глувче; (3) Стратегии за проценка на женските потомци од овие брани. Другите мерења и евалуација на фенотипите не се опфатени во овој ракопис, но може да се најдат во 5, 15, 23, 24, 25, 26.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Тука презентираме детални протоколи за подготовка и инкорпорирање на DHT пелети "и" за репродуктивно и метаболно тестирање. Глувците што биле користени во оваа студија биле со мешана позадина (C57/B6, CD1, 129Sv) и биле згрижени со храна и вода ad libitum во светло-темно циклус од 14/10 часа на 24 ° C на Бродвеј Зграда за истражување на објекти за животни на Медицинскиот факултет на Универзитетот Johnон Хопкинс. Сите постапки беа одобрени од Комитетот за заштита и употреба на животни на Универзитетот sон Хопкинс.

1. Креирајте модел на глувче слично на PCOS

2. Проценка на репродуктивните профили на женски потомци од хронично вметнатите брани на ДХТ

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Тест на нивото на DHT и толеранција на глукоза во серумот

Нивото на DHT беше измерено од собраниот серум и со ELISA и со LC-MS со користење на протокол 1.24-1.25 и 2.9, 3.0. Апсолутните вредности на DHT се разликуваат помеѓу масената спектрометрија и ELISA, меѓутоа релативната преграда на DHT наспроти вметнувањето без DHT е слична и од анализите и од експериментите 15, 23, 24 ((приближно 2-пати)) Слика 2А) Нивото на DHT е значително зголемено кај глувците DHT и без DHT поради предрасуди поради бременост, но нивото на DHT е двојно повисоко кај глувците DHT во споредба со глувците без DHT и кај двата прегестациски глувци (еден ден пред парењето) ) и гестациска возраст (приближно 14 дена) пати (Слика 2 б) Бидејќи ELISA и LC-MS ги разликуваат апсолутните нивоа на DHT, ние ги пресметуваме релативните нивоа (промена на пати: ниво на DHT со вметнување DHT наспроти вметнување без DHT) во рамките на анализите. Femaleенски глувци со DHT покажаа нарушена толеранција на глукоза во споредба со no-DHT 2 недели по вметнувањето на DHT според протоколот 1.23 (Слика 3).

Weightенски потомци телесна тежина и пубертет

Додека генерално се стерилни, некои брани се бремени и имаат кутриња (околу 30% стапка на бременост, така што брани за плодност добиваме од 10 тестови, обично 3 бремени брани, повикајте се на Протокол 2.1). Затоа можеме да ги процениме хроничните ефекти на андрогени во браните врз женското потомство. Femaleенските потомци на вметнатите брани на DHT се нарекуваат ќерки DHT, а оние на браните без DHT се нарекуваат ќерки no-DHT. Ние не забележавме разлика помеѓу ќерките без DHT и DHT за возраста на вагиналниот отвор. Сепак, првиот еструс за ќерките на DHT е значително одложен (35 ден за ќерка без DHT; 42 ден за ќерка DHT). Ова е поврзано со намалена телесна тежина кај 35 и 42 PND кај ќерки во DHT во споредба со ќерки без DHT (Слика 4); упатете се на протокол 2.4 - 2.7).

Нивоа на хормони и еструсна цикличност кај женски потомци

Нивото на тестостерон не се менува во 21 PND, но се намалува во 26PND. Сепак, тестостеронот е зголемен на 70 PND (Слика 5), упатете се на Протокол 2.9-3.0). Возрасни ќерки на DHT покажаа нарушена цистичност на естросот во споредба со возрасните ќерки без DHT, значително подолго од m/d и помалку време во P и E (Слика 6А, Б.; според методот во протоколот 1.17 - 1.22).

глувче
Слика 1: Идентификација на глувчето. Во кафез, увото на глувчето е прикажано со тупаници на друга позиција на бројот на глувчето. Глувчето од 1 до 3 е ставено на десното уво и # 4 до 6 е налево на левото уво кога се гледа грбно. Ако глувчето е удрено со ушите на самото место # 1 и # 4, тоа е # 7; на 2 и 5 е # 8; на 3 и 6 е # 9; во средината на левото уво е # 10; на позиција 1 до 10 е # 11; итн. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

протоколот
Слика 2: Серумски нивоа на DHT. Серумски нивоа на DHT. (А.) Нивото на серумскиот DHT може да се мери со ELISA и масена спектрометрија. Иако апсолутните вредности се различни, двата пати анализи покажаа слични разлики помеѓу глувците DHT и не-DHT третираните. (Б.) Промена на наборот на серумскиот DHT во споредба со нивото на DHT во пред-концепциските и гестациските временски точки. Не-DHT (отворени шипки) и DHT вградени (црни шипки) кај женски глувци пред (еден ден пред парењето) и за време на бременоста (околу 14 дена од бременоста). Вредностите се средни ± S.E.M. N = 5-8 по група. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

протоколот
Слика 3: Тест за толеранција на глукоза (GTT). Имплантирани глувци без ДХТ и ДХТ постеле преку ноќ и се инјектирала интраперитонеално глукоза (2 г/кг БВ), а шеќерот во опашката се мерел во различни временски точки. Глувците третирани со DHT покажале значително зголемено ниво на шеќер во крвта помеѓу 30 и 120 мин. Во споредба со глувци кои не биле третирани со DHT. Вредностите се средни ± S.E.M. N = 4-12 по група. * П 2 е променет, кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

проучување
Слика 6: Хроничниот мајчин вишок на андрогени доведува до нарушена цикличност кај возрасни ќерки. (А.) Претставување на естрозната цикличност на женското потомство. (Б.) Процентот на време поминато на секоја фаза на еструс (Y-оска) во рок од 15 дена (X-оска) мерено со цитолошки преглед на вагинални клетки. Вредностите се средни ± S.E.M. N = 5-9 по група. Фаза на еструсниот циклус (Y-оска). М/г: исполнет/Диетрус; П: Проеструс; Е: Топлина. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

протоколот
Табела 1: Коктел кетамин/ксилазин.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Хиперандрогенизмот е клучна карактеристика на ПЦОС. Серумските нивоа на DHT (две пати повисоки кај DHT глувците отколку кај глувците без DHT) што се користат во овој протокол се пониски од оние пријавени од други истражувачи во претходните студии и се калибрирани на пропорционално имитираат жени со PCOS 5, 19, 20, 21 година. За разлика од другите модели, овој двократна DHT модел не ја менува телесната тежина и составот на целото тело во споредба со глувците без DHT до 3,5 месеци по вметнувањето на DHT 23, 24. Овие возрасни глувци всадени во DHT се одржуваат со постојан егзоген DHT. Иако составот на целото тело не е променет, промената во структурата и функцијата на адипоцитите е забележана кај слабите жени со ПЦОС 20. Гарантирано е внимателно испитување на различните складишта. Забележавме нарушена цикличност на естросот во рок од една недела од вметнувањето на DHT 15 и намалена плодност за време на тримесечен рејтинг на плодност 23.

Малото подмножество на DHT третирани женски глувци што може да забремени и да има потомство даде можност да се оценат ефектите на пред-гестациската, гестациската и старечката хиперандрогенемија врз развојот на фетусот. За да се добие правилно контролиран експеримент, потребни се повеќе кучки за размножување, што бара да се воспостават најмалку 10 парови за парење. DHT ќерките се изложени на DHT само за време на бременоста и пред 21 PNA. DHерките ДХТ покажаа помала телесна тежина во споредба со ќерките без ДХТ, што укажува на тоа дека дебелината или прекумерната тежина не се мешаат варијабли во набудуваните физиолошки ефекти 15 .

Во првичните студии, со текот на времето ги потврдивме серумските нивоа на DHT. Не откривме значителни разлики во серумскиот DHT во 1, 2, 3 и 4 недели 23, 24. Нивото на DHT се намали по 4 недели, така што ги заменуваме DHT пелетите на секои 4 недели. Ние не забележавме намалени ефекти на DHT, кои исто така се чуваа 3 месеци на собна температура. Важно е да се инкубираат пелетите во солена вода 24 часа пред да се вметнат. Овој чекор е важен за дури и ослободување на DHT од пелетот (DHT полека се ослободува низ силастичните цевки). Естозната цикличност може да се провери по 3 дена од вметнувањето на DHT, а вагиналниот брис исто така може да се испита директно во солен раствор без хемикалии и дамки под светлосен микроскоп откако ќе се запознаете со типовите клетки 27.

Метаболниот фенотип може да се процени на или по 2 недели (14 дена) од вметнувањето на DHT. Сепак, ефектите на DHT врз метаболизмот на крајот на четвртата недела (28 дена) се малку ослабени, иако не е забележано слабеење за репродуктивна дисфункција. Затоа, ние обично ја проценуваме метаболичката функција на крајот од 2, 3, 5, 6, 7 недели (внесете 14, вкупно 21, 35, 42 и 49 дена 2 пати). Лабораториско производство на стероидни пелети со бавно ослободување е зрела техника која е широко прифатена од различни лаборатории 33,34. Претставува ефтина алтернатива на комерцијалните производи што се повеќе од 50 американски долари за пелети (90 дена DHT пелети отколку, 5 mg/пелети, IRA, NA-161). Комерцијалниот производ е во предност што не треба да се заменува до 90 дена, додека пелетот опишан во овој извештај мора да се заменува на секои 28 дена. За големи студии, истражувачите може да сметаат дека е поекономично да произведуваат сопствени пелети дури и со дополнителна работа потребна за замена на пелети на секои 4 недели.

Како што е забележано од други, моделите со хронична DHT имплантација по породувањето не покажуваат зголемена фреквенција на пулсирање на LH и ова може да укаже на разни патолошки механизми на зголемена репродуктивна функција предизвикана од андрогени помеѓу развој и доцна стекната хиперандрогенизам. Со овој протокол можеме да ги испитаме женските потомци од хронични хиперандрогени брани. Можеме да го искористиме овој модел за да се обидеме да ги разбереме репродуктивните (на пр. Развој на фоликули, овулација (жолти тела) и плодност) и метаболички последици (на пр. Метаболизам на гликоза или липиди, состав на тело, масно депо. (Дистрибуција). Наш протокол додава нова алатка за испитување на покачени андрогени репродуктивни и метаболички нарушувања и ја оддалечува патофизиологијата предизвикана од покачен андроген од оние што можат да бидат резултат на дебелина. Овој модел може да се користи за проучување на специфичните ефекти на ткивото на покачените андрогени кај жените Покрај тоа, методологијата пријавена овде за производство на DHT пелети лесно може да се примени на проучување на другите стероидни хормони.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.