Идентификација и карактеризација на ATP13A2 варијанти и нивната важност за

Идентификација и карактеризација на ATP13A2 варијантите и нивното значење за невродегенеративните болести Инаугуративна дисертација за добивање на докторски степен на Факултетот за математика и природни науки на Универзитетот во Келн претставена од Андре Хеибах од Есен Келн 2009

карактеризација

Тековната дисертација е објавена со одобрение од Факултетот за математика и природни науки на Универзитетот во Келн при Институтот за генетика на човекот (директор: проф. Д-р Брунхилде Вирт) од Универзитетот во Келн под раководство на проф. Торстен Хоп и Проф. Кристијан Кубиш направи. Рецензент: проф. Торстен Хоп, проф. Д-р. Кристијан Кубиш Ден на последниот усмен испит: 12 јануари 2010 година

Содржина Содржина Содржина Список на кратенки 1 Вовед 1 1.1 Невродегенеративни заболувања 1 1.1.1 Паркинсонизам 1 1.1.2 синдром на Куфор-Ракеб и ATP13A2 5 1.2 АТПаза од типот P 6 1.2.1 Транспорт на материјал низ биолошки мембрани 6 1.2.2 АТП-управувани пумпи 6 1.2.3 Структура на АТПаза од типот П 7 1.2.4 Функционален механизам на АТПаза од типот П 8 1.2.5 Класификација на АТПаза од типот П 10 1.2.5.1 АТАпаза на тип I 11 1.2.5.2 АТПаза на тип II 11 1.2.5.3 АТПаза на тип III 11 1.2. 5.4 Тип IV АТПаза 12 1.2.5.5 Тип V АТПаза 12 1.2.6 Мутации во АТПаза како причина за болести 13 1.3 Цели на работата Колекции) 17 2.6 Деоксирибонуклеотидни трифосфати (dntp) 17 2.7 Вектори на клонирање 18 2.8 Користени уреди 18 2.9 Бази на податоци и други веб-страници 19 2.10 Софтвер 20 2.11 Молекуларни биолошки методи 20 2.11.1 Полимеразна верижна реакција (PCR) 20 2.11.2 Дизајн на прајмер 20 2.11.3 серии на реакција на PCR 21 I

Список АК антитела АБИ Аплицирани биосистеми АП алкална фосфатаза АТП аденозин трифосфат БАЦ бактериски вештачки хромозом БЦА бицинхонинска киселина (бицинхонинска киселина; 2,2-кинолин-4,4-дикарбоксилна киселина) Серумски албумин на БСА говеда (серумски албумин на говеда) Ц цитозин ЦДНА ДНК копија на РНК компе-соединение-хетерозигот DAPI 4 6-диамидино-2-фенилидол ddntp дидеоксинуклеотид трифосфат Дел Делејшн ДМЕМ Дубецо модифициран орлиум диексид ДДОСО 5 трифосфатни dpc дена по коитумот DTT Dethiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EF ембрионски фидер клетки (глувци) ER ендоплазматски мрежи ES ембрионални матични клетки (глувци) F прајмер напред (прајмер во насока напред) F од F c FCS Фрагмент на постојана пропорција на антитела на антитела f серумски етални телешки гванини грамови V

Список на кратенки на час HCl хлороводородна киселина HEK човечки ембрионски бубрег (човечки ембрионални клетки на црниот дроб) хетерозиготи хомозиготна хомозиготна HRP рен пероксидаза (рен пероксидаза) H 2 O вода IgG имуноглобулин од групата G IgM имуноглобулин од групата М IHF интегрален фактор J ouуле к kb килобазни парови kda килодалтони KO нокаутираат KRS синдром Kufor-Rakeb l литарски LAMP лизозом поврзан мембрански протеин LB Лурија Бертани м мили (фактор 10-3) М моларен мили-ампер Мг мегабаза парови мин минути ММЦ митомицин Ц МОПС 3-Н-морфолино-пропансусулфон МПТП 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин МТТ 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиум бромид nano (фактор 10-9) N нормален солен NaCl NADH никотинамид аденин динуклеотид NADPH никотинамид аденин динуклеотид фосфат NaOH раствор на натриум хидроксид Нео неомицин OD n оптичка густина (апсорпција на бранова должина од n нанометри) p пико (фактор 10-12) VI

Список на кратенки PAA PAGE PCR PD PDI ph PIC R rh RNase rpm RT SDS sec T TAE Taq TE TM U UPS UV V WT w/v полиакриламид полиакриламид гел електрофореза полимеразна верижна реакција Паркинсонова болест (Паркинсонова болест) протеин дисулфид изомераза негативен декадиски логаритм на хидроген протеин Инхибиторски коктел обратна буквар (прајмер во обратен правец) релативна влажност (релативна влажност) ревонуклеаза револуции во минута (вртежи во минута) собна температура натриум дудецил сулфат секунди тимин трис-ацетат-ЕДТА Термус акватикус Трис-ЕДТА трансмембранска домен единица - дефинирана единица на ензимската активност убиквитин - Протеазомски систем ултравиолетова светлина волти тежина див тип по волумен VII

Материјал и методи 2. Материјал и методи 2.1 Хемикалии Користени се хемикалии, органски супстанции и растворувачи со квалитетна про-анализа и добиени од следниве компании: Amersham (Freiburg) AppliChem (Darmstadt) BD Biosciences Clontech (Heidelberg) Calbiochem (Darmstadt) Difco Lab (Спаркс/САД) Ферментас Sciencesивотни науки (Св. Леон-Рот) Флука (Тауфкирхен) ГЕ Здравство (Минхен) Инвитроген (Карлсруе) Мерк (Дармштат) Биолаби од Нова Англија (Франкфурт на Мајна) Перкин Елмер (Масачусетс/САД) Пирс (Рокфорд)/САД) Рош (Манхајм) Сигма-Олдрих (Тауфкирхен) 2.2 Потрошен материјал Пластични производи и садови за реакција се добиени од Гринер (Фрикенхаузен) и Сарстет (Нимбрехт). 2.3 Општи раствори Освен ако не е поинаку наведено во протоколот, дестилирана вода (A. dest) се користеше за сите пуфери, раствори и медиуми. TE пуфер (ph 8) 10 mm Tris-HCl 1 mm EDTA и 500 ml HPLC-H 2 O, стерилен филтер, складирање на -20 C TE-4 пуфер (ph 8) 10 mm Tris-HCl 0,1 mm Na 2-ЕДТА стерилен филтер, складирање на -20 C 10 X PBS (ph 7,4) 80 g NaCl 2 g KCl 14,4 g Na 2 HPO 4 2,4 g KH 2 PO 4 автоклав до 1 l H 2 O, Складирање на РТ 16

Материјал и методи 2.7 Вектори за клонирање Таб. 2.2: Користени вектори (векторски мапи во додатокот) Име Опис Големина [bp] Извор pcdna 3.1 V5/Вектор на неговиот израз 5523 Invitrogen pdonr221 Вектор на клонирање 4762 Invitrogen pcdna-dest53 Вектор на изразување 7767 Invitrogen PPNT таргетиран вектор 7200 AG Zimmer p -Vektor 7314 AG Brüning 2.8 Употребени уреди Таб 2.3: Користени технички уреди Уред на уред Производител Автоклав пареа стерилизатор Varioklav H + P Лабораториска технологија Инкубатор Hera Cell 150 Термо електрофореза комора Sub-Cell GT Bio-Rad X-Cell Сигурно заклучување Инвитрогенски систем за електропорирање Ген пулсер систем Биорад капацитет Екстендер Biorad машина за развој Curix 60 Agfa Geiger бројач LB 124 Berthold гел систем за документирање Chemidoc XRS Biorad плоча за греење/мешање MR 3001 кабинет за хибридизација Хајдолф од типот 30 Специјален шејкер за инкубација на Hyb Bachofer Innova 44 микроскоп Axioplan2 Zeiss нуклеинска киселина/уред за мерење на протеини С. научен мерач на PeqLab ph inolab ph ниво 1 WTW помош за пипетирање Истражување Eppendorf PCR систем во реално време Easyypet 7500 PCR систем во реално време (Taq-Man) Eppendorf ултрачист систем за вода Milli-Q; Q-Gard 2 Millipore Roller Shaker Roller Mixer SRT 1 Stuart Applied Biosystems 18

Материјали и методи Sequencer ABI Prism 3100 Genetic Analyzer Applied Biosystems Напонски уреди Power Ease 500 Invitrogen Power Pac Basic Bio-Rad стерилна работна маса Hera Safe KS 12 Kendro Thermoblock Heatblock II VWR Thermocycler icycler Biorad Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems theppermender IKA Benchtop Centrifuge Galaxy Mini VWR Transfer Module X-Cell II Blot Module Invitrogen Ultrasonic Bath Bath USC 100T VWR Ultracentrifuge Avanti J 20 XPi Beckman Coulter UV Crosslinker UV-Crosslinker UV-Cross XLL UV UV UV GS GS Link Linker УВ комора Био Рад Вортекс Добри Хејдолф Баланс на Викон Сарториус (прецизно салдо) ARJ 120-4M Kern водена бања WB22 Мемтер центрифуга 5415D Eppendorf центрифуга 5415R Eppendorf Allegra X-22R Beckman Coulter Varifuge 3.0 RS Kendro 2.9 Бази на податоци и други веб-страници BACPAC Resources Centre BDGs Bio BDGP www BBGs BBGs BVGs BV NEB P-Type ATPases UCSC Векторски дизајнер http://bacpac.ch ori.org/ http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html http://biotools.umassmed.edu/tacg/wwwtacg.php http://www.cbs.dtu.dk/services/ http: //www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.neb.de http://biobase.dk/

exe/patbase.html http://genome.cse.ucsc.edu/index.html https://vectordesigner.invitrogen.com/login.cfm 19