IgG - ttg - Имунолошки одговор кај дијабетес тип 1 со целијачна болест - PDF бесплатно преземање
Универзитетска болница Улм Центар за интерна медицина Клиника за интерна медицина Јас медицински директор: проф. Д-р. Гвидо Адлер се фокусира на ендокринологија, дијабетес и метаболизам проф. Д-р. медицински Бернхард О.Бахм IgG - ttg - имунолошки одговор кај дијабетес тип 1 со целијачна болест Дисертација за добивање на докторска диплома по стоматологија на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Улм презентирана од Тимо Ноче Баблинген 2010 I
Вршител на должноста декан: проф. Клаус-Мајкл Дебатин 1-ви известувач: проф. Бернхард Ото Бам 2-ри известувач: проф. Д-р. Д-р Питер Керн: 22 април 2010 година II
Содржина Список на кратенки 1. Вовед 1 1.1 Дефиниција на целијачна болест 1 1.2 Историја 2 1.3 Епидемиологија и патогенеза на целијачна болест 4 1.4 Форми на целијачна болест 8 1.5 Целијачна болест и други болести 12 1.6 Број 16 2. Материјал и метод 17 2.1 Реагенси, раствори и пуфери 17 2.2 Уреди и потрошни материјали 19 2.3 Серуми на пациенти 20 2.4 Одредување на титар 21 2.4.1 Одредување на титар на ttg-iga 21 2.4.2 Определување на ttg-igg титар 29 3. Резултати 30 3.1 Определување на ttg-iga титар 30 3.2 Определување на ttg-igg титар 32 3.3 Директна споредба на титрите ttg-igg со ttg-iga 34 3.4 Компјутерска споредба на титрите/статистичките резултати 38 IV
4. Дискусија 43 5. Резиме 52 6. Библиографија 53 Додаток V
Список на скратеници АГА антитела против Глиадин АПЦ антигени кои презентираат клетки BSA говедски серумски албумин ЦД кластер на диференцијација ДК, DQ HLA генски локации на хромозомот 6 DZG Deutsche Zöliakie Gesellschaft e.v. ЕЛИСА ензим поврзан имуносорбент ЕМА ендомизиумски антитела ESPGHAN Европско друштво за детска гастроентерологија, хепатологија и исхрана GFD диета без глутен, диета без глутен H 2 SO 4 сулфурна киселина HLA хуман леукоцитни антигени тип на IgM имуноглобулин од типот M IL интерлеукин MHC-мајор Histocompability комплекс ml милилитри MMP матрица металопротеинази mRNA гласник рибонуклеинска киселина PBS фосфатен пуфер TGF фактор на раст на тумор TMB Tetramethylbenzidine TNF Тумор Necrose фактор ttg ткиво Акутна трансглутаминаза Антителата трансглутаминаза ткиво трансглутаминаза ткиво, Geweb; произволна, произволна единица VI
- Контролна биопсија, индицирана во случај на сомнителен клинички успех со диета без глутен - Изложеност на глутен со биопсија, наведено во: - Сомнежи во врска со првичната дијагноза - Дијагноза на возраст од 30/100 епителни клетки) и нормална архитектура на мукозата, хиперпластичен тип II, со хиперплазија на криптата, зголемени интраепителни лимфоцити и нормални вили. и деструктивниот тип III со 3 подвидови a до c, што покажува дебеличка или изедначување на ресичките, хиперплазија на криптата, зголемени интраепителни лимфоцити и воспалителен инфилтрат во ламината проприја (DZG 2009). 11
Ендомизиумските антитела во нормалниот опсег, а исто така и биопсијата на Дуденал покажуваат нормална слика. Пациентите со селективен недостаток на IgA имаат 10 пати поголем ризик од развој на целијачна болест. Сјогренов синдром, опаѓање на косата и Адисонова болест се други нарушувања кои можат да бидат поврзани со целијачна болест. Ризикот од лимфом во тенкото црево е најголем кај пациенти на кои им е дијагностицирана целијачна болест во зрелоста. Рак на фаринксот и хранопроводот, исто така, може да се најде почесто кај пациенти со целијакија. Сепак, најновите студии од 2004 година покажуваат дека постои само умерено зголемен ризик од тумор и дека усогласеноста со строгата ГФД резултира со прилагодување на ризикот за општата популација во рок од 5-10 години (Mäki and Collin 1997, DZG 2009) 15-ти
1.6 Издание Со воведување на серолошка дијагностика и откривање на антитела, преваленцата рапидно се зголеми. Стана јасно дека пациентите со целијачна болест снимени со биопсија се само врвот на ледениот брег. Лошите страни на тестовите за ткиво, тестот за ендомизиум и тестот за ретикулин се високите трошоци и ограниченото снабдување со подлога што мора да се добие од хранопроводот на мајмун. Покрај тоа, потребен е специјално обучен персонал за извршување на овие тестови, бидејќи тестовите се технички многу сложени. (Маки и Колин 1997). Откако ќе се идентификува антигенот ttg, може да се развијат специфични тест комплети за квантитативно откривање на антителата. Тестовите како што е Елиса не само што ја олеснија првичната дијагноза, туку и дијагностицирањето и контролната дијагноза. Вообичаените тестови користат антиген ttg за откривање на IgA и IgG антитела. Оваа теза се фокусираше на дистрибуцијата на IgA и IgG анти-tTG-Ab во контекст на дијабетес тип 1. Целта е да се провери дали резултатите дозволуваат да се извлечат заклучоци за имунолошкиот процес и дали од ова може да се добие подобрување во дијагностиката. 16
2. Материјал и методологија 2.1 Реагенси, раствори и пуфери Celikey IgG PharmaciaDiagnostics (Sweden Diagnostics (Германија) GmbH) Анализа на ткиво трансглутаминаза (хумана, рекомбинантна) IgG антитела за дијагностика in vitro на ленти за микротитер (17996) обложени со човечки, рекомбинантен ttg антиген 6 IgG) стандардни раствори на антитела во концентрации 0 3 7 16 40-100 U/ml во PBS со BSA 0,095% (w/v) натриум азид 1 позитивна контрола со BSA, 0,095% (w/v) натриум азид, детергент и хуман серум во Негативна контрола на PBS 1 со BSA, 0,095% (без напон) натриум азид, детергент и хуман серум во PBS тампон-концентрат 20x PBS концентрат со 0,095% (w/v) натриум азид и пуфер со примерок за детергент со BSA, 0,095% (w/v) натриум азид и детергент, обоен жолт IgG конјугат, анти-хуман IgG пероксидаза, обоен црвен ензимски супстрат TMB (3, 3, 5, 5, тетраметилбензидин) раствор за стопирање, 0,5 MH 2 SO 4, безбоен 17
Celikey PharmaciaDiagnostics (Шведска Дијагностика (Германија) GmbH) Анализа на Трансглутаминаза (хумана, рекомбинантна) IgA антитела за ин витро дијагностика Ленти со микротитер (18196) обложени со човечки, рекомбинантни ttg антиген 6 ttg (IgA) антитела Стандардни раствори во концентрации 0-3 7-16-40-100 U/ml во PBS со BSA 0,095% (во оптек) натриум азид 1 позитивна контрола со BSA, 0,095% (w/v) натриум азид, детергент и хуман серум во PBS 1 негативна контрола со BSA, 0,095% (w/v) натриум азид, детергент и хуман серум во PBS концентрат за тампон за миење 20x PBS концентрат со 0,095% (w/v) натриум азид и детергент Пример пуфер со BSA, 0,095% (w/v) натриум азид и детергент, обоен жолт IgA конјугат, Анти-хуман IgA пероксидаза, обоен црвен ензимски супстрат TMB (3, 3, 5, 5, тетраметилбензидин) раствор за стопирање, 0,5 MH 2 SO 4, безбоен 18
2.2 Уреди и потрошен материјал Eppendorf Hamburg - Пипета референца - мултипепет мултипет плус - Combitipp 1,0 мл, 2,5 мл, 5,0 мл. Water SLT - Spectra microtiter plate meter Epson - LX-400 printer Other - конвенционален персонален компјутер, MS Word 2003, MS Excel 2003 - Synelisa Software Ver. 3.2 јули 1995 година - Винстат и PASW статистички програми за статистика 18 19
2.3 Серуми на пациенти Се користеле серуми на пациенти за кои веќе биле достапни титри на IgA. Беа избрани оние серуми кои имаа IgA титар поголем од 8 U/ml со цел да се избегнат гранични позитивни серуми (сива зона). Од популација од 803 пациенти со дијабетес тип 1, се избрани 73 IgA позитивни серуми од 44 жени и 26 машки пациенти за определување на титулите на IgA и IgG. Полот не може да се додели во 3 примероци. Возраста на пациентите се движи од 4 до 84 години. 25 од пациентите имале IgA титар поголем од 100 U/ml. Серумите на овие пациенти беа испитани понатаму со соодветни разредувања со цел да се измерат титрите на антителата. Табела 1: Преглед на населението, N = број Број на возрасти N Машко женско непознато опсег Студија 1 59 20 38 1 4 84 Студија 2 14 6 6 2 11 83 20
23 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Слика 2: Стандарди на шемата за пипетирање: контроли во црна боја: бели +/- пациенти: бели, нумерирани
2.4.1.3 Графички приказ на постапката за тестирање = хуман, рекомбинантен ткивен трансглутаминазен антиген како цврста фаза Слика 3: Поставување на шематски тест 1 од 10 пипетирање во примероците на серумот = антитело на трансглутаминаза на ткиво, = антиген на трансглутаминаза на ткиво од рекомбинантно ткиво како цврста фаза = други компоненти на клетките
= Антитело на трансглутаминаза во ткиво, = антиген, рекомбинантно ткиво, трансглутаминаза, како цврста фаза = други компоненти на клетката, 1-та реакција: Антителата на трансглутаминазата на ткивата присутни во серумот на пациентот се врзуваат за антигените. Инкубираат 30 мин. Слика 5: Шематски приказ на експериментот Антитела, = хуман, рекомбинантен антиген на трансглутаминаза во ткиво како цврста фаза = други компоненти на клетките Слика 6: Поставување шематски тест 4 од 10 25
Пипетирање во конјугатната анти-хумана пероксидаза = конјугирана анти-хумана пероксидаза = ткиво трансглутаминаза антитело = човечко, рекомбинантно ткиво трансглутаминаза антиген како цврста фаза Слика 7: Шематски приказ на експериментот 5 од 10 = конјугиран анти-хуман пероксидаза = ткиво трансглутаминаза антитело = како солидна фаза 2-та реакција: конјугатот се комбинира со комплексот антиген-антитела. Инкубирајте 30 мин. Слика 8: Поставување шематски тест 6 од 10 26
3 x миење надвор од шуплината со тампон за миење = конјугиран анти-хуман пероксидаза = ткиво трансглутаминаза антитело = човечки, рекомбинантен ткивен трансглутаминазен антиген како цврста фаза Слика 9: Шематски експериментален амбиент 7 од 10 TMB пипетирање во ензимскиот супстрат тетраметилбензидин = конјугат анти-хуман трансглуктаутаза = хуман трансглутати, антиген на трансглутаминаза на рекомбинантно ткиво како цврста фаза = тетраметилбензидин Слика 10: Шематски експериментален амбиент 8 од 10, TMB = тетраметилбензидин 27
= Конјугат на анти-хуман пероксидаза = антитело на трансглутаминаза во ткиво = антиген на човечко, рекомбинантно ткиво трансглутаминаза како цврста фаза = тетраметилбензидин инкубираат 10 мин во мракот Цврста фаза = тетраметилбензидин H 2 SO 4 = тетраметилбензидин по промена на бојата 3-та реакција: -Ензимирано обележан конјугат-антитело-антиген комплекс го поставува подлогата за промена на бојата на подлогата од црвена во жолта - реакцијата се запира со сулфурна киселина -30 мин по запирање може да биде фотометриска оптичките густини се определуваат на 450 nm Слика 12: Поставување шематски тест 10 од 10, H 2 SO 4 = сулфурна киселина 28
Табела 2: Тест Колмогоров-Смирнов за нормална дистрибуција со корекција на значењето според Лилиферс за ttg (ига) и ln [ttg (ига)], ttg (ига) = антитела од типот А против трансглутаминаза на ткивата, ln = логаритам до основата e, n = број Колмогоров-Смирнов n Значење ttg (ига) 73,000 ln [ttg (ига)] 73,032 Слика 13: Хистограм на апсолутните вредности на титарот на ttg (ига) со нормална крива на дистрибуција, ttg (ига) = антитела од типот А против трансглутаминаза на ткиво Слика 14: Хистограм на логаритамскиот Вредности на титарот за базата e на ttg (ига) со нормална крива на дистрибуција, ln = логаритам за базата e, ttg (ига) = антитела од типот А против ткивната трансглутаминаза 31
Слика 15: Хистограм на апсолутните вредности на титарот на ttg (igg) со нормална крива на дистрибуција, ttg (igg) = антитела од типот G против трансглутаминаза на ткиво Слика 16: Хистограм на вредностите на логаритамизираниот титар за основата e ttg (igg) со нормална крива на дистрибуција, ln = логаритам до основата e, ttg (igg) = тип Г антитела против ткивна трансглутаминаза 33
3.3 Директна споредба на титрите ttg-igg со ttg-iga Во директна споредба на резултатите од определувањето на титулата ttg-iga и ttg-igg и компаративната графичка репрезентација на титулите на испитаниците, станува јасно: 93% (69 од 73) од примероците ги имаат примероците Титар на IgA над оној на IgG; кај 7% од нив (5 од 69) вредноста е значително поголема од онаа на IgG (види слика 17-24). Меѓутоа, во 7% (5 од 73) од примероците, титарот на IgG е поголем од оној на IgA (види слика 17-24). Кога се гледаат графиконите на графиконите на IgA и IgG во споредба, може да се види следново: Вредностите на IgA и IgG не корелираат едни со други, т.е. Х. висок ttg-iga титар не резултира со висок ttg-igg титар. - Исто така, низок IgA титар не е поврзан со низок IgG титар и обратно. - Ако, пак, постои висок титар на IgG, тогаш има и висок титар на IgA. во споредба со титарот на IgA-IgG 900 800 700 600 500 титар 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 примерок број ttg (IgA) ttg (IgG) Слика 17: титарот на IgG-IgG во споредба со ttg, примерокот број 1 -10, ttg (IgA) = антитела од типот А против ткивна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела од типот Г против ткивната трансглутаминаза 34
ttg IgA-IgG титар во споредба 400 350 300 250 титар 200 150 100 50 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Примерок број ttg (IgA) ttg (IgG) Слика 18: ttg титар IgA-IgG во споредба, примерок број 11- 20, ttg (IgA) = антитела од типот А против трансглутаминаза во ткивата, ttg (IgG) = антитела од типот G против титарот на ткивата трансглутаминаза ttg IgA-IgG во споредба 500 450 400 350 300 300 титар 250 200 150 100 50 0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Примерок број ttg (IgA) ttg (IgG) Слика 19: ttg IgA-IgG титар во споредба, број на примерок 21-30, ttg (IgA) = антитела од типот А против трансглутаминаза на ткиво, ttg (IgG) = антитела од типот Г во споредба со ткивниот трансглутаминаза ttg IgA-IgG титар во споредба 1000 900 800 700 600 титар 500 400 300 200 100 0 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 број на примерок ttg (IgA) ttg (IgG) Слика 20: ttg IgA-IgG титар во споредба, Примерок број 31-40, ttg (IgA) = антитела од типот А против ткивна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела од типот G против трансглутаминаза на ткивата 35
ttg IgA-IgG титар во споредба 300 250 200 титар 150 100 ttg (IgA) ttg (IgG) 50 0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 примерок број Слика 21: ttg IgA-IgG титар во споредба, број на примерок 41-50, ttg (IgA) = тип А антитела против ткивна трансглутаминаза, ttg (IgG) = тип G антитела против ткивна трансглутаминаза ttg IgA-IgG титар во споредба 1400 1200 1000 титар 800 600 400 200 0 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 број на примерок ttg (IgA) ttg (IgG) Слика 22: ttg IgA-IgG титар во споредба, број на примерок 51-60, ttg (IgA) = антитела од типот А против трансглутаминаза на ткиво, ttg (IgG) = антитела од типот G против ткивна трансглутаминаза ttg IgA- Титар на IgG во споредба 400 350 300 250 титар 200 150 100 50 0 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 примерок број ttg (IgA) ttg (IgG) Слика 23: ttg IgA-IgG титар во споредба, број на примерок 61-70, ttg (IgA) = антитела од типот А против ткивна трансглутаминаза, ttg (IgG) = антитела од типот Г против ткивната трансглутаминаза 36