Индукција на воспаление на цревата во мозокот со присвојно пренесување на ефективни CD4 CD45R високи Т-клетки

Апстракт

Постојат многу различни животински модели за проучување на патогенезата на човековото воспалително црево (ИБД), секој со свои предности и недостатоци. Ние опишуваме овде еден експериментален модел на колитис кој е инициран со посвоен трансфер на сингеична слезина ЦД4 + ЦД45РБ високи Т-клетки во приматели на глувци со дефицит на Т-Б CD4 + CD45RB популацијата на високи Т-клетки, главно составена од наивни ефекторни клетки, може да предизвика хронично воспаление на цревата, многу слично на важните аспекти на човечкиот IBD. Оваа постапка може да се манипулира за да се испитаат аспектите на почетокот и прогресијата на болеста. Покрај тоа, може да се искористи за проучување на функцијата на вродена, прилагодлива и регулаторна популација на имунолошки клетки и улогата на факторите на животната средина, односно микрофлората при воспаление на цревата. Во оваа статија го објаснуваме методот на индукција на колитис користејќи чекор-по-чекор протокол. Ова вклучува видео демонстрација на клучните технички аспекти потребни за успешно развивање на овој глушечки модел на експериментален колитис за истражувачки цели.

Протокол

ЗАБЕЛЕШКА: Осигурете се дека сите протоколи за животни се одобрени од и во согласност со регулативата на Комитетот за грижа и употреба на институционални животни (IACUC) и прирачникот за Национален совет за истражување за грижа и употреба на лабораториски животни. Глувците донатори можат да бидат машки или женски, но глувците приматели треба да бидат машки. Ако треба да се користат приматели на жени, глувците донатори мора да бидат жени 5. Одржувајте колонии редовно, користејќи нестерилни легла и некиселена вода, бидејќи тие влијаат на цревната флора, а со тоа и на фенотипот на колитис кај глувците.

1. Користете ладно-ладни медиуми и тампони. За време на експериментот, чувајте ги клетките на мраз.
2. Изведете го експериментот во стерилна хауба за биоопасност користејќи стерилна технологија.

2. Изолација на Т-клетки на слезината

3. Збогатување на ЦД4 + Т-клетки

Забелешка: Следете ги упатствата на производителот за специфични производи што се користат во овој дел.

4. Етикетирање и сортирање на ќелиите 7

Слика 1: Застапености на цитометрија на проток на популации на Ц-клетки CD4 + CD45RB при анализа на FACS (А. - В) Спленоцитите опфатени со FITC CD4- и PE CD45RB од глувци донатори C57BL/6 беа сортирани според FACS во CD4 + CD45RB високи и CD4 +. CD45RB ниски популации на Т-клетки. (А) Двојни настани исклучени на заплетот за предниот расеј. (Б) Лимфоцитите беа заградени во графикони нанапред и странично расејување. (C) ЦД4 + Т-клетките беа затворени, и (Г) ЦД4 + ЦД45РБ + Т-клетките беа нацртани на хистограм на ПЕ наспроти настани. Ниските клетки CD4 + CD45RB се сметаа за најниски 20% од клетките CD45RB +. Високите клетки CD4 + CD45RB се утврдени дека се највисоки 40% CD45RB + клетки.

1. Извршете дел од секоја популација на клетки на машината FACS за да ја процените чистотата на популацијата.
2. Cellsелии со големина на центрифуга на 450 g за 7 мин, пресуспендирање во 1 ml PBS. Отстранете ги количините на клетки за да се избројат и проценат одржливоста на клетките со исклучување на трипан-сина боја како во чекор 2.9.

5. Инјекција на клетки во приматели

1. Ресуспендирајте ги сортираните клетки на 4 x 10 6 клетки/ml (висок CD45RB) или 2 x 10 6 клетки/ml (CD45RB ниско) во PBS.
2. Пренесете 100 μl високи клетки CD45RB по примач во нови стерилни цевки. Додадете 100 μl PBS по примач на оваа цевка. Вкупната количина инјектирана по животно е 200 μl, а вкупната количина на клетки по примач е 4 × 10 5 CD4 + CD45RB многу наивни Т-клетки.
3. Доколку е посакувана експериментална група што содржи регулаторни Т-клетки, тогаш додадете нови 100 μl ЦД45РБ-клетки по примач на нови стерилни цевки. 100 μL CD45RB ниски клетки по примач на истата цевка. Вкупната количина на инјектирање по животно е 200 µl; Сооднос на CD45RB висока: CD45RB ниски клетки е 2: 1.
4. Инјектирајте 100 μl CD45RB висока или CD45RB висока/ниска CD45RB CD4 + клетки интраперитонеално во десната и левата страна на стомакот (вкупно 200 μl) на секој примач.

6. Следење на прогресијата на болеста кај животните приматели

1. За да се процени клиничката состојба на животните приматели, вкупните клинички резултати за следните параметри доделуваат 8 на денот на инјектирање, после тоа неделно и при жртвување:
   1. Одредете трошење со мерење на слабеење: 0 - нема губење на тежината; 1 - 0,1-10% губење на оригиналната телесна тежина; 2 - повеќе од 10% губење на оригиналната телесна тежина (Слика 2А).

Слика 2: Клинички и патолошки знаци на воспаление по пренесувањето на диви-тип ЦД4 + ЦД45РБ високи Т-клетки се јавуваат кај глувците приматели на Rag1 -/- и на НРДКО 11 (А) Примателите на НРДКО изгубиле во просек 10% од нивната оригинална телесна тежина 5. Неколку недели по пренесувањето, додека Rag1/примателите не покажуваат клинички знаци на болест во тоа време. Секоја точка претставува просечен процент на почетна телесна тежина за групата ± СЕМ. ** P -/- и глувците примачи на NRDKO се задебелени и скратени во споредба со дебелото црево од глувците Rag1 -/- и NRDKO без трансфер на посвојување на Т-клетки. Децата од глувците примачи на NRDKO покажуваат сериозно воспаление и зголемена дебелина (податоците не се прикажани). Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Приближно 10 х 10 6 ЦД4 + ЦД45РБ високи Т-клетки од 10 слезини возрасни донатори C57BL/6 се сигурно изолирани. Овој број ќе варира во зависност од возраста и видот на глувчето донатор и вештината на истражувачот. Кога 4 x 10 5 C57BL/6 CD4 + CD45RB високи Т-клетки се пренесат во C57BL/6 Rag1 -/- глувци примачи, клиничките знаци на болеста се јавуваат околу 5 недели по заситеноста или порано ако глувците се генетски склони кон потешка болест ( Слика 2, 3) 11.12. ЦД3 + Т-клетките може да се видат во дебелото црево во примателот Rag1 -/- веќе во 3 недели (3А) 12-ти.

Слика 3: Пренос на CD4 од див тип + CD45RB високи Т-клетки во Rag1 -/- и RKO/δ KD примачи предизвикуваат хронично воспаление на цревата 12 (A) (Оригинално проширување 10X, H&E и CD3 Имунохистохемија). Боење со H&E (горните панели) покажува хиперплазија на епителот, инфлатрирани клетки и апсцеси на криптите (стрела) присутни во примателот RKO/δ KD, но не и примателот Rag1 -/-. Дебели од глувци приматели на RKO/δ KD покажаа значителна акумулација на ЦД3 + Т клетки со ЦД3 IHC (долни плочи) во споредба со дебелото црево од примателите на Rag1 -/-. (Б) Децата од глувците приматели на RKO/δ KD покажале потешко воспаление во споредба со дебелото црево од глувци Rag1 -/- приматели, утврдени со хистолошки резултат. (Ц, Г) Културни култури на експлантација од глувци приматели на RKO/δ KD лачеле помалку IL-10 (C) и IL-12p40 (Г) отколку што е направено култури на експлантација на дебело црево на Rag1 -/-. Глувците приемници кликнете овде за да ја видите поголемата верзија на сликата.

Претходно објавивме дека трансферот на Т-клетки во Nfil3 -/-/Rag1 -/- приматели на двоен нокаут (NRDKO) развива тежок колитис во споредба со глувците примачи на Rag1 -/- (Слика 2) 11. NFIL3 негативно го регулира IL-12p40 во макрофагите на глувчето дебело црево, без оглед на неговиот ефект на поттикнување на IL-10 13. Дисрегулацијата на IL-12p40 и IL-10 е во патогенезата на човечката IBD 1. Така, неконтролирано производство на IL-12p40 при посвојување Глувците примачи на NDRKO резултираат во побрза прогресија на болеста, како што се губење на тежината (2А) прикажано. Некои глувци примачи на НРДКО развија сериозна болест, што резултираше со пролапс на дебелото црево (2 Б). Груби, дебело црево од глувци приматели на NRDKO се задебелени и скратени, што овозможува голема имиграција на воспалителни клетки во дебелото црево, во споредба со Rag1 -/- приматели на глувци (2С).

Компаративно кај глувци Rag1 -/- со нефункционална каталитичка единица p110 δ PI3K кај нелимфоцитни популации (RKO/δ KD), CD4 + CD45RB високи Т-клетки предизвикале слично брз и сериозен клинички тек на болеста во споредба со надополнување Глувци од НРДКО (3) 12. Хистолошката анализа по 3 недели покажува хипертрофија на ткиво на дебелото црево, воспаление, инфилтрати на торични клетки и апсцеси на крипти (стрела) во примателот RKO/δ KD во споредба со примателот Rag1 -/- (3А). Глувците приматели во овој експеримент биле еутаназирани 3 недели поради значителен број кои изгубиле 20% од нивната оригинална тежина. Хистолошки резултати, како слепи за тест-групите од страна на патолог и утврдени врз основа на специфични критериуми развиени во нашата лабораторија 12, во споредба со Rag1 биле повисоки кај глувците примачи на RKO/δ KD -/- глувци примачи (3Б). Покрај тоа, спонтаното производство на цитокин од култури на експлантација на дебело црево покажа намалено производство на IL-10 и IL-12p40 од страна на RKO/δ KD глувци примачи во споредба со Rag1 -/- приматели на глувци (3С, Г) 12. Повторно, зголемен IL-12p40 и намалено производство на IL-10, вмешано во патогенезата на човечкиот IBD 1.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Овде опишуваме чекор-по-чекор протокол за поттикнување на воспаление на дебелото црево кај глувци со посвоен трансфер на ЦД4 + ЦД45РБ + Т-клетки кај глувци со имунодефициенција. Користевме донаторска слезина C57BL/6 и сингенески глувци приматели Rag1 -/- приматели, иако други соеви (на пр. BALB/c, 129S6/SvEv, недебесен дијабетичар (NOD)) и генетски модели на имунодефициенција (на пр. SCID, Rag2 -/- - ), исто така може да се користи 4,14-16. Добро е познато дека потекот на позадината влијае на сериозноста на експерименталниот колитис кај глувците 1. Покрај тоа, цревната микрофлора кај популацијата на глувци значително варира помеѓу институциите, вклучително и меѓу оние во истата институција 6,17. Додека 2 и 3 не покажа развој на колитис кај Rag1 -/- глувци по 4 недели по пренесувањето, според нашето искуство и на другите приматели на Rag1 -/- да развијат клик-болест помеѓу 6 и 9 недели по пренесувањето на CD4 + CD45RB високо-Т -Цели 18-23. Оваа варијабилност во клиничкиот тек и изразувањето на болеста и треба да се чува што е можно пониско при поставување на овој модел на експериментален колитис на интра- и интер-експериментална недоследност.

Чекори на протоколот што бараат оптимизација се Дел 3: Збогатување на ЦД4 + Т-клетки и Дел 4: Означување и сортирање на ќелиите. Оптимизирањето на збогатувањето на ЦД4 + Т-клетките зависи од користениот систем на магнети и треба да ги следи упатствата на производителот. Опциите на системот за раздвојување на магнетни клетки се дадени во Табела на специфични реагенси/додатоци наведени. Препорачливо е збогатување на ЦД4 + Т-клетките со негативен избор, бидејќи директното обележување на оваа популација може да влијае на фенотипот на клетките. Постојат многу клонови на антитела на располагање за обележување на клетките за FACS. Концентрацијата на антитела (чекор 4.4) треба да биде оптимизирана за да се обезбеди специфично боење и соодветно раздвојување на популациите на Т-клетките CD4 + CD45RB за време на FACS.

Овде ја опишуваме методологијата на добро карактеризираниот адаптивен глувчешки трансфер модел на хронично воспаление на тенкото црево и дебелото црево што наликува на човечки IBD 5 Овој чекор по чекор протокол обезбедува клучни техники за успешно развивање на овие постапки за истражувачки цели. Ова е особено корисен животински модел на човечка IBD бидејќи овозможува синхронизирање на болеста и манипулирање со различни популации на клетки. Сепак, глувците со примање на имунитет се генетски модифицирани без развој на зрели адаптивни имунолошки клетки, што веројатно ќе влијае на процесите на низводно заболување. Како и да е, методот опишан овде ќе се покаже многу корисен во идните студии за утврдување на ефектите на цревната микрофлора, вродените клетки на имунолошкиот систем и адаптивните клетки на имунолошкиот регулатор во патогенезата на човечкиот IBD.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Признанија

Оваа работа беше поддржана од Наградата за научно истражување на Американското друштво за гастроентерологија (АГА) и Наградата за развој на кариера на Фондацијата Крон и Колитис на Америка (CCFA) (SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) и Центарот за гастроинтестинална биологија на Универзитетот во Северна Каролина и грантови за болести P30 DK34987 (јадро на хистологија). Основниот објект за цитометрија на проток на УНЦ е делумно поддржан од грант за основна поддршка на Центарот НЦИ (P30CA016086) при сеопфатниот центар за рак на УНЦ Линебергер. Му благодариме на Лукас Б. Борст од колеџот за ветеринарна медицина на Државниот универзитет во Северна Каролина за помошта во хистопатолошката анализа и имунохистохемијата.

---