Изразување на клеточниот инхибитор на протеин-2 на апоптозата кај човечки поткожен и

  • апстрактен
  • вовед
  • Методи
  • Предмети и земање примероци
  • Подготовка на РНК и RT-PCR
  • Изолација на протеини и анализа на вестерн блот
  • Откривање на апоптоза
  • Статистичка анализа
  • Резултати
  • дискусија
  • благодарноста

апстрактен

ЦЕЛ: Во присутни Во оваа студија, се занимававме со прашањето дали постои специфичен депот израз на клеточен инхибитор на протеин-2 на апоптоза (cIAP2) уште во детството и дали релативниот израз се менува со зголемување на возраста со зголемен ризик од висцерална дебелина.

Предмети: 23 пациенти (12 деца и 11 возрасни) примени спарени примероци на човечко масно ткиво (ОМ) и поткожно масно ткиво (СК).

МЕТОД: На Нивоата на cIAP2 mRNA беа утврдени со употреба на обратна транскрипција полимеразна верижна реакција (RT-PCR) и протеински израз потврден со вестерн бот. Индексите на апоптоза беа утврдени со терминално обележување на ник-крајот флуоресцеин со средство на деоксинуклеотидилтрансфераза (TUNEL).

РЕЗУЛТАТИ : cIAP2 mRNA беше 1,51 пати повисок во ОМ отколку во СС масно ткиво (ОМ> СК кај 20 од 23 испитаници; П СЦ кај девет од 10 испитаници, П 1

Дебелината се карактеризира со зголемување на масата на масното ткиво. Масната телесна маст, особено акумулацијата на висцерална маст, е тесно поврзана со инсулинска резистенција, кардиоваскуларни заболувања, висок крвен притисок и други сериозни метаболички нарушувања. 2 Ова ја покажа важноста на идентификување на генетските фактори кои ја регулираат не само масната маса, туку и дистрибуцијата на маснотии.

Познато е дека оменталните (ОМ) и поткожните адипоцити (СК) се разликуваат во различните метаболички својства кои го регулираат волуменот на масните клетки. 3, 4 Се чини дека репликацијата, диференцијацијата и апоптотичкиот одговор на човечките масни клетки се под влијание на анатомскиот регион. 5, 6. Дистрибуцијата на масното ткиво може да се припише на разликите специфични за локацијата во регулирањето на овие процеси. Неодамна е докажано дека регионалните карактеристики можат да бидат поврзани со специфични за локацијата разлики во експресијата на гените кои кодираат важни функционални протеини. 7 На пример, изразот на лептин и PPAR γ е повисок во СЦ отколку во масното ткиво ОМ. 8, 9 Спротивно на тоа, изразот на рецепторот на инсулин (пр. 11-) е поголем во ОМ отколку во СС масното ткиво. 9

Инхибиторот на клеточната апоптоза протеин-2 (cIAP2) припаѓа на семејството на протеини на апоптоза (IAPs), кое е вклучено во регулирањето на апоптозата за време на пролиферацијата и диференцијацијата на клетките. 10, 11, 12 Улогата на IAP во човечкото масно ткиво не е јасна, но сè поголем број докази сугерираат дека тие можат да играат улога во регулирањето на дистрибуцијата на масните наслаги преку модулација на апоптозата на масните клетки. Еден извештај покажа дека зависно од диференцијација изразувањето на инхибиторниот протеин на невронската апоптоза (NAIP) во 3T3-L1 адипоцитите може да биде во корелација со развојот на отпорност на адипоцитите кон апоптозата. Две понатамошни студии објавија дека cIAP2 mRNA е депо-специфично изразено во возрасни човечки масни клетки. 14, 15

Досега, истражувањето за разликите во изразот на гени се фокусираше на возрасните. Многу малку се знае за специфичната локациска генска експресија кај масното ткиво кај децата. Бидејќи постојат возрасни зависни разлики во однос на масата и дистрибуцијата во човечкото масно ткиво, се занимававме со прашањето дали постои деп-специфичен израз на cIAP2 веќе во детството и, ако е така, дали релативниот израз се менува со зголемувањето на возраста Дебелината. Во сегашната студија, затоа ги споредивме изразните нивоа на cIAP2 и на нивоата на mRNA и на протеините во масното ткиво ОМ и СЦ на деца и возрасни. Покрај тоа, ја испитавме врската помеѓу нивото на изразување на cIAP2 и стапката на адипоцитна апоптоза, индексот на телесна маса (БМИ) и полот.

Методи

Предмети и земање примероци

Подготовка на РНК и RT-PCR

Нивото на mRNA на cIAP2 беше утврдено кај сите субјекти кај кои вкупната РНК беше достапна и од масното ткиво од СЦ и ОМ. Вкупната РНК е подготвена со употреба на реагенсот ТРИзол (Invitrogen Life Technologies, CA, САД) според протоколот на производителот. РНК беше квантифициран спектрофотометриски. Интегритетот на РНК беше потврден со боење на етидиум бромид на рибозомални РНК-ленти со употреба на 1% агарозен гел. Добиената РНК се чуваше на -70 ° C сè додека не се искористи.

РТ-ПЦР беше извршена за да се анализира mIA-јата cIAP2. Вкупната РНК (0,5 × 1 μg) беше извлечена 1 час на 42 ° C во 20 μl пуфер кој содржи 200 U MMLV обратна транскриптаза, 0,5 μg олиго d (T) 16, 0,5 mmol/l dNTP, 20 U RNase инхибитор, обратен транскрибиран. Комплементарни примероци на ДНК (cDNA) беа денатурирани 5 мин на 95 ° C и беа користени 5 μl cDNA од секој примерок за последователно PCR засилување во последен волумен од 50 μl пуфер кој содржи 2,5 U Taq ДНК полимераза, 0, 2 mmol/L, содржани dNTP, 2,5 mmol/L MgCl 2 и 0,4 μmol/L на секој прајмер. Условите на PCR беа 95 ° C за 5 минути, проследени со 30 циклуси од 94 ° C за 30 секунди, 60 ° C за 45 секунди и 72 ° C за 1 минута и конечно продолжување од 72 ° C за дополнителни 10 минути. Реагенсите за РТ ги снабдуваше Промега Корп. (Медисон, САД). Реагенсите за ПЦР беа од Рош (Манхајм, Германија). Во овој полуквантитативен РТ-ПЦР, истовремено се користеа две групи на прајмери ​​(Табела 1). Користени се различни броеви на ЦЦР циклуси за да се осигура дека засилувањето и на cIAP2 и на β-актин cDNA е во експоненцијалниот опсег. Букварите за β-актин беа додадени во шестиот циклус на секое засилување на PCR.

По засилување, 10 .mu. л од смесата одделена на 1,5% гел од агароза, обоен со етидиум бромид. Гелите беа визуелизирани под УВ светлина, се мери густината и односот на cIAP2 до β-актин и се анализираат со помош на софтвер за квантификација, верзија 4 Виндоус и Макинтош (лаборатории Био-Рад, Херкулес, Калифорнија, САД).

Изолација на протеини и анализа на вестерн блот

Откривање на апоптоза

Апоптотичните адипоцити во 15 спарени примероци беа откриени со терминално обележување на дексин-нуклеотидил трансфераза со ДУТП-флуоресцеин-ник-крај (TUNEL) според протоколот на производителот. Апоптотичните индекси се добиени со броење 200 адипоцити во најмалку четири видни полиња под светлосен микроскоп.

Статистичка анализа

Податоците беа анализирани со помош на Статистичкиот пакет за општествени науки (SPSS) и P вредноста помала од 0,05 додели значење. Бидејќи изразот cIAP2 не беше дистрибуиран нормално во масното ткиво, тој е прикажан во текстот и табелата како медијана (меѓу-честички опсег). Тестот за потпишан ранг Вилкоксон беше искористен за споредување на разликите во изразот помеѓу СЦ и ОМ; Тестот Ман-Витни беше искористен за споредување на специфичните депо-разлики помеѓу деца и возрасни. Корелациите се пресметани со помош на тестот за коефициент на корелација Спирман.

Резултати

Споредувањата во парови на изразувањето на mRNA на cIAP2 од масното ткиво СЦ и ОМ беа квантифицирани со RT-PCR, како што е прикажано на слика 1а. Имаше извонредна варијација во нивото на изразување помеѓу индивидуите, особено во ОМ (1б). Како и да е, постоеше значителна депо-специфична разлика во нивото на изразување на cIAP2 mRNA (Табела 2). mIA-ja cIAP2 беше 1,51 пати поголем во ОМ отколку во масното ткиво СЦ (ОМ> СК кај 20 од 23 испитаници; П.

инхибитор

Специфични за депот разлики во изразот на mRNA на cIAP2. (а) Пример за анализа на агарозен гел по RT-PCR на спарени примероци на масно ткиво СЦ и ОМ од пет лица. (б) Растерите покажуваат дека изразот на cIAP2 mRNA е присутен во маснотиите на SC и OM од сите лица. Хоризонталните шипки ја означуваат средната вредност.

Western blots се прикажани на Сл. Во согласност со изразот на mRNA, содржината на протеини cIAP2 беше поголема во ОМ отколку во СЦ (ОМ> СЦ кај девет од 10 испитаници, П.

протеин-2

Специфични за депот разлики во експресијата на протеините на cIAP2. (а) Пример на имуноблоти на cIAP2 протеини од СС и ОМ масно ткиво од четири лица. (б) Растерите покажуваат изразување на протеини cIAP2 во маснотии во О и ОМ од 10 лица. Хоризонталните шипки ја означуваат средната вредност.

Имунохистохемиската анализа не покажа никаква разлика помеѓу СЦ и ОМ во апоптотичните индекси на адипоцитите (апоптотски индекси 14 кои покажаа повисок израз на mRNA на cIAP2 во ОМ отколку СД адипоцити кај возрасни. Истите автори исто така покажаа дека изразот на МИА на cIAP2 кај човечки преадицити на ОМ е повисок од оној на маснотијата СЦ.15 Сепак, нивната студија се фокусираше само на нивото на mRNA. Бидејќи изразот на mRNA не секогаш го одразува изразот на протеинот или концентрацијата на целосно обработен протеин, ние го проширивме набvationудувањето додавајќи потврдивме дека главната разлика помеѓу ОМ и СЦ масното ткиво се јавува и на ниво на протеини.

CIAP2 првично беше идентификуван како протеин поврзан со сигналниот комплекс на TNF-α рецептори, што сугерира дека може да биде вклучен во регулирањето на сигнализацијата на TNF-α. 16 Преголема експресија на хуманиот протеин cIAP2 може да ја потисне клеточната смрт предизвикана од различни стимули. Во споредба со изолирани човечки адипоцити, предипоцитите култивирани во серумско средство имаат поголеми нивоа на mRNA на cIAP2 и исто така помала чувствителност на апопотоза предизвикана од TNF-α. 14, 15, 17 Затоа, изразот на cIAP2 во масното ткиво СЦ и ОМ може да ја рефлектира депо-специфичната подложност на апоптоза и со тоа да предизвика губење или таложење на масно ткиво.

Во оваа студија не можевме да откриеме никаква разлика во стапката на базалната апоптоза помеѓу адипоцитите од двете депоа. Веројатно објаснување е дека базалните апоптотски индекси биле прениски за точно да се измерат и да се споредат. Ова гледиште е поткрепено со фактот дека Prins et al. 17 покажа дека базалниот апоптотски индекс на масни клетки култивиран во медиум кој содржи серум е многу низок, без оглед на употребениот метод. 6 Сепак, не можеме да исклучиме дека користениот метод е премногу нечувствителен за да се открие разликата во индексите на апоптоза помеѓу двете места во масното ткиво, што може да биде во корелација со разликата во изразот на cIAP2. Покрај тоа, физиолошката улога на специфичната локациска разлика во cIAP2 во масното ткиво допрва треба да се испитува.

Сумирајќи, го споредивме изразот на cIAP2 mRNA во масно ткиво во СЦ и ОМ кај 12 деца и 11 возрасни. Поголем релативен израз во ОМ во споредба со СС масно ткиво е пронајден кај деца и возрасни. Ова сугерира дека различното изразување на cIAP2 помеѓу депоата може да се должи на својствените својства на клетките од двете депоа. Поизразената специфична депо-разлика кај децата може да рефлектира нето добивка во висцералното масно ткиво за време на растот.

благодарноста

Оваа работа беше поддржана од Фондот за научно истражување на комитетот за образование во ianиангсу (99KJD 320012) и Шведскиот совет за медицинско истражување (19X-05708). Им благодариме на г-дин Ксу Кјаокун, г-дин Лу Јао, г-дин Чен Јиијанг и проф. Питер Нареди за обезбедување примероци на масно ткиво за овие студии и на професорот Томи Олсон за плодни дискусии.