Клонирање
Што е со еден ваш клон? Некој што станува наутро и оди на училиште за вас, дали вашите домашни работи и ја средуваат просторијата за да имате доволно време за кино? Одлична идеја, или можеби не?
4. Алатките за клонирање на гени
Истражувачите користат разни молекуларни алатки за клонирање. Ензимите за ограничување (поточно рестрикционите ендонуклеази), кои можат да ја препознаат и исечат ДНК на одредени позиции, се неопходни. Ензимите за ограничување се наоѓаат во бактериите и се споредуваат со кучињата чувари: Тие ги штитат бактериите од пенетрација на вируси. Ензимите за ограничување ја препознаваат вирусната ДНК и ја распаѓаат во процес наречен ограничување. Ензимите за ограничување можат да прават разлика помеѓу вашата и странската ДНК, бидејќи вашата сопствена ДНК е хемиски обележана од метил група, која работи како знаме. Странската ДНК, сепак, не го носи ова знаме.
Ензимите за ограничување работат исклучително специфично: Тие препознаваат кратки ДНК низи и ја пресекуваат ДНК нишката во овој момент. Ензим за ограничување што често го користеле истражувачите во експериментите се нарекува Eco RI, првиот ензим за ограничување откриен во бактеријата ешерихија коли (E. coli). Ја препознава и сече секвенцата GAATTC, оставајќи ги таканаречените лепливи краеви (видете ја филмската низа „Рекомбинантна ДНК технологија“). ДНК парчиња (фрагменти) создадени на овој начин може да се поврзат повторно релативно лесно едни со други (види слика 2.1).
Покрај ензимите за ограничување, плазмидите се друга алатка за клонирање. Плазмидите се „генски такси“: тие можат да заземат туѓа ДНК и да ја пренесат на бактериите. Бактериите, на пример, E. coli, потоа го преземаат производството на гените и протеините. Бактериите E. coli се главните органи за тестирање во многу лаборатории и се најистражуваните живи суштества.
За да успее клонирањето, истражувачите користат трик: Користените плазмиди имаат и ген кој им дава на бактериите кои ја проголтуваат плазмидната отпорност на антибиотикот ампицилин. Овој отпор ќе се покаже важен подоцна.
Во нашиот експеримент, ензимот за ограничување Еко РИ ја сече човечката ДНК што ја добивме од примерокот на плунка. Ова создава илјадници парчиња ДНК - од кои едниот содржи ген на инсулин што го бараме. Ние ги користиме истите ензими за намалување на бактериските плазмиди. Поради лепливите краеви, можеме да ги собереме поединечните парчиња заедно. Многу плазмиди нема да соберат ништо, многу ќе земат човечка ДНК, а неколку ќе го земат генот на инсулин што го бараат. Сите плазмиди потоа се воведуваат во бактериите E.coli.
Сега ги дистрибуираме сите бактерии на чинија со хранлив медиум, на кој бактериите во принцип не можат да растат бидејќи плочата содржи антибиотик ампицилин. Со овој чекор, пченицата е одделена од плевата: Сите бактерии кои проголтале плазмид, можат да растат на плочата и да формираат колонија затоа што плазмидот ги прави отпорни на ампицилин. Бактериите се размножуваат и со нив посакуваниот ген на инсулин.
Во овој момент клониравме илјадници парчиња човечка ДНК, и не само оние што нè интересираат. Следниот чекор, скринингот на сите колонии, е многу сложен.
Како можеме да го најдеме оној што го носи нашиот ген на инсулин од сите илјадници клонови? Ако веќе знаеме дел од ДНК секвенцата на инсулинскиот ген, тогаш можеме да произведеме парче mRNA долга околу 30 базни парови, што ќе се прицврсти на низата гени на инсулин како сонда. Оваа сонда е радиоактивна или етикетирана со флуоресценција, така што можеме да утврдиме со кои клонови се пристани. Благодарение на оваа сонда, го наоѓаме клонот што го содржи нашиот ген на инсулин (види слика 2.2). Со оваа техника, може да се клонираат многу други гени, на пример, за хормони за раст и интерферон, генски производи кои исто така се користат како лекови.
Клонирањето на гени сега е успешно завршено и станува јасно зошто се користат бактерии за овие, а не за повисоките организми: повисоките организми се размножуваат сексуално. За овие живи суштества, сексуалноста има предност што се комбинира генетскиот состав и дека од него произлегуваат нови лица со нови карактеристики. Ова создава предности во еволуцијата. За истражувачите, сепак, оваа нова генетска комбинација е нарушувачка бидејќи може да го промени и генот на инсулин.
Истражувачите треба да работат со животни кои се генетски идентични: само клоновите секогаш реагираат на ист начин во експериментот. Кога истражувачите сакаат да тестираат лек, тие секогаш користат глувци од ист вид. Таквите соеви на глувци се одгледуваат со помош на крвни сродници или тесно поврзани животни се прекрстуваат едни со други.