Компоненти на храната и нивното влијание врз патогенезата на автоимуниот дијабетес кај луѓето и
ТЕХНИШЕ УНИВЕРЗИТ МИНЧЕН Чаир за нутриционистичка физиологија Нутриционистички компоненти и нивното влијание врз патогенезата на автоимун дијабетес кај луѓе и глувци Даниела Бетина Милер Комплетна копија на докторската теза одобрена од Вајенстефан научен центар за исхрана, употреба на земјиште и одобрение на Технички универзитет во Минхен Доктор на науки за домаќинство и исхрана Претседател: Испитувач на дисертацијата: Унив.-Проф. Д-р J. J. Hauner 1. Унив.-Проф. Д-р H. Daniel 2 апл.проф.д-р. А-Г. Зиглер Дисертацијата е доставена до Техничкиот универзитет во Минхен на 5 јануари 2010 година и прифатена од Вајенстефан научен центар за исхрана, употреба на земјиште и животна средина на 25 февруари 2010 година.
За моите двајца дедовци
Содржина Содржина 1 Задача. 1-3 2 Вовед и преглед на литература. 4-23 2.1 Основи на дијабетес тип 1. 4 2.1.1 Важноста на генетиката. 5-6 2.1.2 Патогенеза и имунолошка позадина на дијабетес тип 1. 6-8 2.2 Wheито и неговите протеински фракции. 8-9 2.2.1 Целијачна болест и асоцијација помеѓу дијабетес тип 1 и целијачна болест. 10-14 2.2.2 Влијание на пченичните протеини врз развојот на автоимун дијабетес кај животински модели. 14 2.2.3 modelsивотински модели на дијабетес тип 1. 14-15 2.2.4 Влијание на факторите во исхраната врз развојот на автоимун дијабетес кај животински модели. 16 2.3 Кравјо млеко и неговите протеински фракции. 17-18 2.3.1 Влијание на протеините од кравјо млеко врз развојот на автоимун дијабетес кај животински модели. 18-19 2.4 Влијание на пченично и кравјо млеко кај дијабетес тип 1 кај луѓето. 19-21 2.5 Асоцијација помеѓу имунолошкиот систем поврзан со цревата и автоимуниот дијабетес. 21-22 2.6 Други компоненти на храната и нивна можна поврзаност со дијабетес тип 1. 22-23 3 Материјал и методи. 24-41 3.1 Истражувања на моделот на глувчето НОД. 24 3.1.1 Колектив на глувци. 24 3.1.2 Диети. 24-27 3.1.3 Делумен експеримент на протоколот 1 и 1а. 27-29 3.1.4 Делумен експеримент на протокол 2. 29-30 3.1.5 Делумен експеримент на протокол 3. 31 И.
Содржина Содржина. Список на фигури. Список на табели. Список на кратенки. I-V VI-VIII IX-X XI Претходни публикации. XII биографија. XIII-XIV благодарност. XV V
Список на слики Сл. 26 Поврзување на IAA со млеко, млечни протеини, формули и пченица во споредба со хуман инсулин. 74 Сл. 27 Сврзувачки криви на IAA со компонентите на храната 75 Сл. 28 Сврзувачки криви на IAA со млечните протеини. 76 Сл. 29 Врзување на IAA со разни млечни протеини во споредба со инсулинот (дел 1). 77 Сл. 30 Врзување на IAA со разни млечни протеини во споредба со инсулинот (дел 2). 78 Сл. 31 Поврзување на IAA со разни млечни протеини во споредба со инсулинот (дел 3). 79 VIII
Список на табели Таб. 20 Анализа на концентрацијата на протеини на извлечените раствори на храна во разни разредувања и добиените средни вредности. 66-67 Таб. 21 Карактеристики на испитаните лица чија IAA се врзува за екстракт од млеко во прав. 73 X
Слика на АК антитела Asp asparagine cpm радиоактивни распаѓања во минута (брои во минута) GAD (A) (антитела против) глутамат декарбоксилаза HLA комплекс на хистокомпатибилност (хуман леукоцитен антиген) I (A) A Инсулин (авто) антитела IA-2 (A ) (Антитела против) протеини тирозин фосфатаза IA-2 антитела на островските клетки ИС имуноглобулин МХЦ главен комплекс на хистокомпанибилност мин. Минута nb не е познато НОБ необичен дијабетичен RBA радиолигантен врзан анализа вртежи во минута круга во минута T1D тип 1 дијабетес. Табела TBST Tris пуфер солен раствор плус Tween TBT Tris пуфер Tween t-tg ткиво-трансглутаминаза наспроти Светската здравствена организација ZnT8 цинк транспортер 8 XI
За да може да се поставуваат задачи што би можеле да се сметаат за потенцијални првични целни антигени на IAA. Генерално, ова дело треба да го разработи можното влијание на индивидуалните компоненти на храната врз имунолошкиот процес на автоимун дијабетес. Користејќи ги податоците добиени in vivo на моделот NOD, потенцијалните дијабетогени компоненти на храната се тестираат на човечки серуми. Користејќи ги овие ин витро модели, ќе се испита до кој степен имунолошките настани на дијабетес тип 1 првично може да бидат активирани од вкрстени реакции со компоненти на храна. Резултатите од овие експерименти може да опишат понатамошни, претходно непознати механизми на патогенеза на дијабетес и на тој начин да се користат за развој на примарни терапии за да се спречи развојот на дијабетес тип 1 во раното детство. 3
Материјал и методи (диета Д), втората група остана на диетата А што содржи пченица и третата група остана на диета без пченица Б. femaleенските кученца од групата за размножување на глутен и диета Ц без казеин беа распоредени во тест група која се состоеше од 9 недели возраст женски животни кои останале на диета Ц (види слика 4). Парови за размножување Диета без глутен, содржана казеин Б диета без глутен и без казеин Ц Групи за тестирање Исхрана B n = 12 Исхрана A n = 12 Диета Д n = 12 Исхрана C n = 9 Сл. 4 Распределба на женските глувци НОД на групите за размножување и тест во делумниот тест 1. Машките млади животни од групата за размножување на диета Б без глутен беа одделени од браните по лактација на возраст од три недели како што е опишано за женските животни и поделени во три тест групи. Аналогно на групирањето на женските глувци, една од групите добила референтна диета (диета Д), втора доби диета А што содржи пченица, а третата група останала на диета Б без пченица (види слика 4а). Парови за размножување, диета без глутен, содржана казеин Б Групи за тестирање Исхрана B n = 11 Исхрана A n = 10 Диета Д n = 12 Сл. 4а Распределба на машките глувци НОД на групите за размножување и тестирање во под-експериментот 1а. 28
Материјал и методи Со цел да се одделат протеинските фракции содржани во пченицата едни од други, беше извршена модифицирана екстракција во три фази, при што албумини и глобулини беа присутни во супернатантот во првиот чекор на екстракција, проламините (глиадините) беа содржани во супернатантот во вториот чекор на екстракција и Во последниот чекор, глутенините беа одделени (Вилсон и Гулдинг 1991, Мимуни и др. 1998, Никола и др. 1998, Идрис и др. 2003). Екстракција на брашно од албумини и глобулини Центрифугирање> 2x талог Екстракција на Глиадин Центрифугирање> 3х Глутелин екстракција на талог (N 2 атмосфера) Центрифугирање> 2x центрифугирање на сите супернатанти Врнежи Складирање на 18 C Слика 7 Шема на екстракција на протеини и одделување на фракциите од пченично брашно Се мерат 0,1 g комерцијално достапно пченично брашно од типот 550, се додава 1 ml пуфер Sörensen (pH 7,35) и смесата се тресе на 4 ° C 20 минути. По центрифугирање (20 мин., 1000 вртежи во минута, Sorvall RC 5B Superspeed Центрифуга) на 4 ° C, супернантот се отстрани и талогот се извлекува повторно со истиот метод по додавање на пуфер Соренсен. Двете супернанти се комбинираа и се чуваа на 4 ° C сè додека не завршија понатамошните фази на екстракција. 33
Материјали и методи Се таложат комплекси со антитела. По центрифугирање, 60 μl надградбата беа отстранети и пренесени во нова цевка. Откако на овие цевки им се додадоа 10 μl анти-хуман IgA агароза во 40 μl TBT пуфер, инкубацијата се спроведуваше повторно на 4 ° C за еден час додека се тресеше. Потоа следуваа чекорите за перење опишани во 3.2.5 за сите цевки (протеин G-Sepharose и IgA агароза) и мерењето во γ-бројачот. и 3.3 Статистика Евалуацијата на кумулативниот ризик за дијабетес и фреквенциите на дијабетес во моделот NOD беше извршена со анализи за преживување. Тестот за најавување-ранг беше искористен за споредување на различните групи во моделот NOD. Споредбите на резултатите од инсулин и преваленцата на антителата меѓу групите во моделот NOD беа извршени со употреба на непараметарскиот тест Ман-Витни У. Корелацијата помеѓу релативната врска на IAA со пилешкиот инсулин и афинитетите на IAA е утврдена со помош на Спирмен-овата корелација. Афинитетите помеѓу индивидуалните групи беа споредувани со тест Ман-Витни У. Во сите анализи, вредностите на стр