Користење на ин витро флуоресцентна резонанца на трансфер на енергија за проучување на динамиката на протеинските комплекси на

Резиме

Интеракциите на протеини-протеини се од клучно значење за биолошките системи, а студиите за врзувачка кинетика овозможуваат увид во динамиката и функцијата на протеинските комплекси. Ние опишуваме метод што ги квантифицира кинетичките параметри на протеинскиот комплекс со користење на трансфер на енергија со резонанца на флуоресценција и техника на запрен проток.

Апстракт

Вовед

Биолошката активност на крајот се спроведува од протеини, од кои повеќето комуницираат со другите за соодветни биолошки функции. Користејќи компјутерски пристап, вкупната количина на протеински-протеински интеракции кај човекот се предвидува да биде 650 000

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Преземете ја датотеката за структура на комплексот Cul1 • Cand1 од Банката за протеински податоци (датотека 1U6G).
Покажете ја структурата на комплексот во PyMOL Cul1 • Cand1.
Функција за мерење под менито " Асистенти „од PyMOL да се процени растојанието помеѓу првата аминокиселина на Cand1 и последната амино киселина Cul1 (Слика 1)).
Преземете го гледачот на спектар на Интернет (видете Табела на материјали) и прикажуваат спектри на возбуда и емисија на 7-амино-4-метилкумарин (AMC) и блиц истовремено (Слика 2) Имајте на ум дека АМЦ е донатор на вознемиреност, а Блиц е прифаќач на вознемиреност.

Слика 1: Кристалната структура на Cul1 • Cand1 и мерење на растојанието помеѓу потенцијалните места за обележување. Датотеката со кристалната структура е преземена од Банката за протеини (датотека 1U6G) и е прегледана во PyMOL. Мерењата помеѓу избраните атоми беа извршени од PyMOL. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 2: спектри на возбуда и емисија на флуоресцентни бои за Bund. Се прикажуваат спектрите AMC (7-амино-4-метилкумарин) и FlAsH. Нацртаните линии покажуваат спектри на возбуда, а цврстите линии покажуваат спектри на емисии. Сликата првично беше генерирана од флуоресценцијата SpectraViewer и е изменета за поголема јасност. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

2. Подготовка на Cul1 AMC • Rbx1, FRET донаторски протеин

Конструирајте плазмиди за изразување на човечка Cul1 сортаза • Rbx1 во клетките на E. Coli. Забележете дека двата плазмиди кои изразуваат човечки Cul1 • Rbx1 во клетките на E. Coli се детално опишани во претходниот извештај 20.
1. Додадете ДНК секвенца со кодирање "LPETGGHHHHH" (сортаза, ден 6) на 3 'крај на Cul1 кодираната секвенца со стандардни PCR и клонирани методи 21, 22 .
2. Редоследот на новиот плазмид се потврдува дека вметнувањето на генот е точна.
Co Express Cul1 сортаза • Rbx1 во клетките на E. Coli. Методот е изведен од претходниот извештај 20.
1. Измешајте 100 ng од два плазмиди со BL21 (DE3) хемиски компетентни клетки за ко-трансформација користејќи го Методот на удар на топлина 23. Расте клетки на агар плочата ЛБ со 100 µg/mL ампицилин и 34 µg/mL хлорамфеникол на 37 ° C преку ноќ.
2. Инокулирајте 50 ml LB култура со свежо трансформирана колонија и растејте преку ноќ на 37 ° C, тресејќи со 250 вртежи во минута. Ова дава почетна култура.
3. Инокулирајте 6 шишиња, секое со 1 L LB медиум со 5 ml стартер култура, секое и расте на 37 ° C со 250 вртежи во минута тресејќи до OD600
  
  3. Подгответе Flash-Cand1, протеинот рецептор на Бунд
  
  Белешка: Повеќето чекори во овој дел се исти како Чекор 2. Условите што се разликуваат се детално опишани подолу.
  
  40 μM со пренесување на пуферот преку ултрафилтрација на мембраната (пресек од 30 kDa). Проценете ја концентрацијата на протеинот користејќи ја апсорпцијата на 280 nm. Зачувајте го протеинот како 50 μL количества на -80 ° C.
  Белешка: Протоколот може да се паузира тука.
Создавање на Flash Cand1.
1. Додадете раствор на флеш 1 μL (види Табела на материјали) до 50 μL раствор на TetraCys Cand1.
2. Измешајте добро и инкубирајте ја смесата на собна температура во темница 1-2 часа до FlAsH Cand1.
  Белешка: Протоколот може да се паузира тука.

4. Подгответе го Cand1, протеинот брканица Bund

ЗАБЕЛЕШКА: Протоколот за подготовка на протеини е сличен на чекор 3 со следниве промени.

Вметнете ја кодот за кодирање на Cand1 со вечерна должина во векторот pGEX-4 t-2.
Променете го тампонот користен во чекор 3.3.5 во пуфер кој содржи 30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DVB-t, 10% глицерол.
Елиминирајте ги чекорите 3.3.7 и 3.3.8.

5. Тестирајте ја и потврдете ја анализата на Бунд

6. Измерете го обединувањето на константната стапка (купување) на Cul1 • Cand1

ЗАБЕЛЕШКА: Деталите за работата на флуориметарот запрен проток беа опишани во претходниот извештај 26.

7. Измерете ја константата на стапката на дисоцијација (koff) на Cul1 • Cand1 во присуство на Skp1 • F-кутија протеин.

Белешка: Овој чекор е сличен на чекор 6 со следниве промени.

Во шприц А, под позиција да пополни, исполни, Вметнете раствор од 100 nM Cul1 AMC • Rbx1 и 100 nM FlAsH Cand1 во пакетот тампон. Завртете го примерот за позицијата "DRIVE".
Вметнете во шприцот Б под положбата да пополни, исполни, решение на Skp1 • Skp2 (подготвено според претходниот извештај 20). Завртете го примерот за позицијата "DRIVE".
Отвори го тоа Контролен панел под стекнуваат Програмирајте AMC за снимање во софтверот и емисија на Cul1 за 30 секунди. Потоа, снимете еден удар. Флуоресцентни сигнали се зголемуваат со текот на времето по мешање на раствори А шприц и шприц Б (Слика 5)).

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Слика 3: Анализа на репрезентативен бунд за формирање на комплекс Cul1 • Cand1. Примероците во пакетот пуфер (30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0,5 mM DVB-t, 1 mg/mL овалбумин, pH 7,6) беа ентузијастички на 350 nm и емисиите беа скенирани од 400 nm до 650 nm. (А) Спектри на емисија од 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 (полн) и мешавина од обете (FRET). Cand1 (целосен) се залага за целосна должина Cand1. (Б) Спектри на емисија од 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 и мешавина од двете (FRET). Во овој експеримент и потоа беше искористен Cand1 со првиот избришан спирала. (C) Спектри на емисија на потера од 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1, мешавина од двете (FRET) и контрола за Bund (Chase). Примерокот Chase содржеше 70 nM Cul1 AMC, 700 nM Cand1 и 70 nM FlAsH Cand1. (Г) Спектри на емисија од 70 nM Cul1 AMC, мешавина од 70 nM Cul1 AMC и 70 nM FlAsH Cand1 (пакет) и 700 nM Skp1 • Skp2 додаден на комплексот 70 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1. Во секоја парцела, емисиските сигнали беа нормализирани до емисијата на 70 nM Cul1 AMC на 450 nm. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

За да се измери набавката на Cul1 • Cand1 користејќи го воспоставениот тест FRET со намалување на сигналот на енкодерот со текот на времето на мониторот за флуориметар со запрен проток, ние прво ја тестиравме и утврдивме концентрацијата на протеинот што треба да се користи. Кога се користеа 5 nM Cul1 AMC и FlAsH Cand1, беше забележана многу мала промена на сигналот (Слика 4А) додека кога концентрацијата на секој протеин беше зголемена на 50 nM, беше забележано намалување на сигналот со текот на времето (Слика 4б.)) и оваа промена беше укината кога тампоните без FlAsH Cand1 (Слика 4)) е додадено. Затоа, 50 nM Cul1 AMC беше искористена за понатамошна анализа, а голем број на забележани стапки на асоцијација (kObs) беа измерени со мешање на 50 nM Cul1 AMC со зголемување на концентрациите на FlAsH Cand1. KObs за секој експеримент е пресметано со вклучување на референци на експоненцијална крива, а kObs добиени од истата концентрација на FlAsH Cand1 се просечни. Нацртајте ги просечните kObs со концентрацијата на Cand1 и линеарна регресија (Слика 4)) изврши, набавката е утврдена 7.27 .

Слика 4: Репрезентативно мерење на константата на брзината на клубот. (А) флуоресценцијата на 5 nM Cul1 AMC беше следена со флуориметар запрен проток со текот на времето по додавање на 5 nM FlAsH Cand1. (Б) флуоресценцијата на 50 nM Cul1 AMC беше следена со флуориметар запрен проток со текот на времето по додавање на 50 nM FlAsH Cand1. (C) флуоресценцијата на 50 nM Cul1 AMC беше следена со флуориметар запрен проток со текот на времето по додавањето на пуферот Bund. (Г) купете за обврзницата Cand1 до Cul1. k-Obs на Cul1 • Се прикажуваат Cand1 во различни концентрации на Cand1. Линеарна падина дава набавка 1,8 x 10 7 M -1 s -1. Да се прикажат лентите за грешки EM SEM; n = 4. Сите примероци беа подготвени во пакет тампони и возбудени на 350 nm.Филтер за пропусен опсег беше искористен за да се соберат сигнали од AMC и да се исклучат сигналите на гром. Ниту еден податок не беше нормализиран. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слично на мерењето на набавката, ја измеривме стапката на константа што се забележува на дисоцијација на Cul1 • Cand1 со следење на зголемувањето (обновување) на сигналот на донаторот со текот на времето на флуориметарот запрен проток. Cul1 AMC и FlAsH Cand1 беа измешани најпрво, а потоа Skp1 • Skp2 беше додаден на претходно собраниот Cul1 AMC • FlAsH Cand1 на флуориметарот запрен проток. Сигналот за кодирање рапидно се зголемува и открива kObs од 0,4 s -1 (Слика 5)) Спротивно на тоа, кога беше додаден тампон на претходно собраната Cul1 AMC • FlAsH Cand1, не беше забележано зголемување на сигналот, што укажува на брза дисоцијација на Cul1 • Cand1 беше активиран од Skp1 • Skp2.

Слика 5: репрезентативно мерење на константата на стапката на дисоцијација. Промената во флуоресценцијата на донаторот во споредба со времето беше измерена по додавање 150 nM Skp1 • Skp2 или пуфер Бунд на 50 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 комплекс. Промените на сигналот беа прилагодени на експоненцијалната крива и има забележана константна стапка на дисоцијација 0,4 s -1. Експерименталните услови беа слични на оние на слика 4опишани. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Бидејќи секирот е чувствителен и квантитативен, тој стана важна алатка за проучување на интеракцијата помеѓу макромолекулите. Овој протокол дава пример за употреба на треска за проучување на динамиката на протеинскиот комплекс во растворот. Bund исто така се користи заедно со снимање на живи клетки за да се проучат молекуларните интеракции во живите клетки 36, што е моќно во откривањето на динамиката на протеинските комплекси под физиолошки услови. Покрај тоа, вознемиреноста може да се користи и на ниво на единствена молекула, проучувајќи ја динамиката во реално време на макромолекуларните комплекси 37, 38, проучувајќи ги увидите во конформациската промена на комплексот. За да се подобри ефикасноста и откривањето на вознемиреност, голем интерес имаат флуорофорите и биосензорите со осветленост и фотостабилност, кои активно се развиваат и проучуваат 28, 39 .

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.