Квантификација на атеросклероза кај протоколот на глувци (во превод на германски)

Резиме

Мурските модели на атеросклероза се корисни алатки за проучување на патогени патеки на молекуларно ниво, но бараат стандардизирана квантификација на развојот на лезијата. Овој протокол опишува оптимизиран метод за одредување на големината на лезијата во главните артерии, вклучувајќи го аортниот корен, аортниот лак и брахиоцефаличната артерија.

Апстракт

Кардиоваскуларните болести се водечка причина за смртност во светот. Во повеќето случаи, основната причина е артериосклероза, која е делумно хронично воспалително заболување. Експерименталните студии за атеросклероза ја разјаснија улогата на холестерол и воспаление во процесот на болеста. Ова доведе до успешни клинички испитувања на активни фармацевтски состојки кои ги намалуваат клиничките манифестации на атеросклероза. Внимателни и добро контролирани експерименти врз модели на глувци на болеста може дополнително да ја разјаснат патогенезата на болеста, што не е целосно разбрано. Стандардизирана анализа на лезијата е важна за да се намали експерименталната варијабилност и да се зголеми репродуктивноста. Одредување на големината на лезијата во аортниот корен, аортниот лак и брахиоцефаличната артерија се вообичаени крајни точки во експерименталната атеросклероза. Овој протокол обезбедува технички опис за проценка на атеросклероза на сите овие места во еден глушец. Протоколот е особено корисен кога материјалот е ограничен, како што често се случува кога се карактеризираат генетски модифицирани животни.

Вовед

Кардиоваскуларните болести се водечка причина за смрт во светот со исхемично срцево заболување и мозочен удар, што претставува еден од четири смртни случаи 1. Повеќето случаи се предизвикани од атеросклероза, болест која се карактеризира со бавно натрупување на плаки што содржат липиди со знаци на хронично воспаление во големи и средни артерии 2. Болеста обично останува незабележана неколку децении додека прекин или ерозија на плаката не предизвика артериска тромбоза, што доведува до оштетување на исхемичното ткиво.

Нормална артерија се состои од интимален слој со ендотелијални клетки и ретко распоредени мазни мускулни клетки, медиумски слој со мазни мускулни клетки и еластични ламели и околен адвенцијален слој со лабаво сврзно ткиво 3. Интимното задржување на ЛДЛ компензира за развој на атеросклероза 4. Акумулацијата и модификацијата на липопротеините доведуваат до агрегација и заробување во артериската интима 5. Воспалителен одговор е предизвикан од зафатените и модифицирани липопротеини 6. Ендотелните клетки почнуваат да изразуваат молекули на адхезија, како што е VCAM-1, на местата во артериското дрво со бурен проток на крв, што резултира со регрутирање на циркулирачки моноцити и други леукоцити 7. Инфилтрирачките моноцити се разликуваат во макрофаги, кои го зафаќаат липидот со последователна конверзија во клетки на пена од макрофаг 8 .

Атеросклерозата се изучува кај модели на глувци со зголемена фреквенција од средината на 80-тите години на минатиот век. C57BL/6 е најчесто употребуваниот род на глувци за овие студии и се користи како генетска позадина за поголемиот дел од генетски модифицираните соеви 9. Овој вид е основан во 1920-тите години на минатиот век, а неговиот геном е објавен 11 во 2002 година. Експериментите во моделите на глувци имаат неколку предности: колониите брзо се размножуваат, куќиштето заштедува простор, а вкрстувањето ја намалува експерименталната варијабилност. Моделот овозможува и генетски манипулации, како што се насочени бришење на гени и вметнување на трансгени. Ова доведе до ново патофизиолошко разбирање на болеста и нови терапевтски цели 12.

Глувци од див тип C57BL/6 се природно отпорни на артериосклероза. Тие имаат поголем дел од циркулирачкиот холестерол во ХДЛ, а комплексни атеросклеротични лезии не се формираат дури и кога се хранат со диета со многу маснотии и високо холестерол 13. Хиперхолестеролемичните глувци, како што е Апое -/- на позадината C57BL/6, затоа се користат како експериментални модели на артериосклероза 14, 15. Недостатокот на ApoE ја нарушува апсорпцијата на остатоците на липопротеините во црниот дроб и сериозно го нарушува метаболизмот на мастите. Кај апое -/- глувците, циркулирачкиот холестерол главно циркулира во VLDL честички и глувците развиваат сложени атеросклеротични плаки на редовна диета на Chow.

Ldlr -/- глувците имитираат развој на артериосклероза кај луѓе со семејна хиперхолестеролемија 16. На глувците Ldlr -/- им треба западна диета за да развијат вид на вид 17. Западните диети ја имитираат потрошувачката на луѓе и обично содржат 0,15% холестерол. Рецепторот на ЛДЛ ги препознава ApoB100 и ApoE и посредува во навлегувањето на ЛДЛ честичките преку ендоцитоза. ЛДЛ рецепторите се основни за дозволувањето на црниот дроб на ЛДЛ од циркулацијата, додека изразот на ЛДЛ рецепторите во хематопоетски клетки не влијае на овој процес. Ова ја отвора можноста за трансплантација на коскена срцевина на Ldlr +/+ клетки во хиперхолестерол Ldlr -/- примател и проценка на развојот на артериосклероза. Химерите на коскената срцевина биле широко користени за проучување на вмешаноста на хематопоетски клетки во експерименталната атеросклероза. Сепак, трансплантацијата на коскена срцевина може да влијае на големината и составот на атеросклеротични плаки, со што толкувањето на резултатите е двосмислено.

Различни варијанти на глувци Апое -/- и Лдлр -/- со дополнителни генетски модификации се развиени за проучување на специфични процеси на болеста 18. Пример се човечки APOB100-трансгенични Ldlr -/- (HuBL) глувци кои го носат целиот човечки ген APOB100 19, 20. Овие глувци развиваат хиперхолестеролемија и атеросклероза на редовна диета со чау. Сепак, развојот на комплексни атеросклеротични плаки трае најмалку шест месеци и пократки експериментални протоколи обично користат западни диети 21. Голем дел од плазма холестеролот циркулира во ЛДЛ честички, што им дава на глувците HuBL повеќе човечки дислипидемичен липопротеински профил во споредба со глувците Апое -/- и Лдлр -/-. Глувците HuBL исто така дозволуваат студии за човечки ApoB како автоантиген 22 .

Моделите на глувци на атеросклероза развиваат сложени атеросклеротични плаки со заеднички карактеристики на човечки болести. Сепак, плаките се прилично отпорни на руптура со последователен миокарден инфаркт. Атеротромбозата е спорадично докажана и е експериментално предизвикувачка за проценка на 23, 24, 25. Развиени се специјални модели на кршење на плаки, но пробното поле нема сигурен и репродуктивен модел за проценка на стабилизаторите на плаките.

Квантификацијата на атеросклерозата е пријавена на многу начини во литературата. Неодамнешните напори се обидоа да го стандардизираат експерименталниот дизајн, однесување и известување за студии врз животни 26. Истражителите имаат различни преференции и техники прилагодени на нивните лаборатории. Повеќето истражувачки проекти се исто така уникатни на начин што бараат некои протоколни промени. Поради мултифакторната природа на болеста, оптималните контроли ќе варираат од проект до проект. Локалните услови и недостаток на стандардизација може да доведат до забележани разлики во развојот на болеста, што го попречува напредокот на областа на истражувањето. Разликите во експерименталната варијабилност исто така значат дека пресметките за статистички перформанси мора да се засноваат на пилот студии под локални услови.

Квантификацијата на артериосклерозата се препорачува на неколку места во васкуларното дрво. Овој протокол опишува како да се добијат резултати од аортниот корен, аортниот лак и брахиоцефаличната артерија во еден глушец, покрај оставањето на остатокот од торакоабдоминалната аорта за друга анализа. Подготовките за лице овозможуваат брза квантификација на плаки оптоварени со липиди во аортниот лак. Оптоварувањето на болеста во брахиоцефаличната артерија може да се измери и кога примероците се внимателно визуелизирани. Подолготрајниот пресек на коренот на аортата остава на располагање повеќе делови за детална проценка на составот на плаката.

Протокол

Сите експерименти врз животни бараат одобрение од етичките власти.

1. sacrificeртвување на глувчето и микродисекција на аортата

Слика 1: Срцето и аортниот лак in situ. (А.) Белите дробови, душникот, хранопроводот и тимусот се отстрануваат за да се прикаже аортниот лак in situ кај 20-годишно женско апое -/- глушец на редовна диета со микрограф, ширина на скалата = 2 мм. Точките со точки означуваат каде да се исечат аортниот лак и нејзините гранки. (Б.) Шематски приказ на срцето и аортата. Точката со црвена боја означува каде треба да се пресече срцето пред да се постави коренот на аортата. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

2. Анализа на лице на аортна артерија и брахиоцефалична артерија

Слика 2: Квантификација на атеросклеротична лезија. (А.) Аортен лак од 20 недели старо човечко машко APOB100-трансгенично Ldlr -/- (HuBL) глувче кое се хранило со западна диета за десет недели прицврстено отворено и обоено со Судан IV за плаки богати со липиди. Целото подрачје на аортниот лак е нацртано со линијата со точки во бело во микрографот, лента за размер = 2 mm. Точките со жолта боја ја оцртуваат вкупната површина на брахиоцефаличната артерија. (Б.) Пресек на аортниот корен на 400 m од аортниот синус кај 20-годишен маж Ldlr -/- глушец кој се храни со западна диета за осум недели, визуелизиран во микрограф, лента за размер = 500 m. Точките со црна боја ја оцртуваат целата васкуларна област и атеросклеротичните лезии, дамка со маслена црвена боја О и се наоѓа во артериската интима. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

3. Криосекција на коренот на аортата

Слика 3: Организација на слајдови за сериски делови на коренот на аортата. За време на криосекцијата на коренот на аортата, треба да се собере секој дел со дебелина од 10 m, што се протега над првите 800 m на асцендентната аорта. Потребна е систематска организација на слајдови за да се добијат соодветни делови за различни намени. Анализата на составот на лезијата обично вклучува боење на маслото Red Red O за липиди и црвената боја на Picrosirius за колаген. Останатите делови се собираат и фиксираат ацетон за имунохистохемија и имунофлуоресцентно боење. Оваа бројка е променета од Gistera et al 30. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

4. Боење на маслото Red O и квантификација на атеросклероза во корените на аортата

Резултати од репрезентацијата

Oil Red O е растворлива во маснотии, светло црвена боја на дизазо, која обојува неутрални липиди. Поларните липиди во клеточните мембрани не се обоени. Боењето на маслото црвено О може да се изврши на свежи, замрзнати или фиксирани со формалин примероци, но не и на примероци вградени во парафин поради отстранување на липидите во потребниот процес на деоксирање. Квантификација на акумулацијата на лезии на лезии може да се изврши со отекување на бојата на маслено-црвената О-позитивна област на целата област на лезијата (Слика 4С) Хематоксилин создава сина дамка на клеточните јадра што е корисно за визуелизација на морфологијата на плаките. Десните и левите коронарни садови обично отстапуваат од аортата за 250 m од аортниот синус 27, што често се совпаѓа со најистакнатите големини на лезиите. Пресеците од овој регион честопати се прикажуваат како репрезентативни резултати (Слика 4Д).

Маслото Red O може да се користи за боење на аортите подготвени за лице, но овој протокол го користи Судан IV, друга погодна дисазо боја растворлива во масти. Судан IV јасно ги визуелизира атеросклеротичните плаки во портокало-црвена боја со боење на липиди, триглицериди и липопротеини. Отстранувањето на темната позадина во репрезентативните слики на аортните лакови на лицето може да ја подобри визуелната претстава (Слика 5А)) Обично, големината на лезијата е поделена на групи, што овозможува статистичко тестирање со студентски Т-тест помеѓу групи. Заговор за расејување што покажува и индивидуални глувци и просекот во споредба помеѓу групите е информативен начин за прегледување на резултатите (Слика 5B-C) Бидејќи варијацијата во рамките на групите обично е различна помеѓу положбите во васкуларното дрво, обично се потребни посебни пресметки на перформансите. Непотребните отстапувања може да се избегнат преку методичка компетентност и стандардизација на протоколот. Добивањето на статистички значајни резултати е важно, но секогаш мора да се земе предвид биолошката важност за набудуваната разлика.

Слика 5: Атеросклеротични лезии во аортниот лак и брахиоцефаличната артерија. (А.) Претставнички микроскопи за лице со аортни лакови со плаки што содржат липиди, обоени со Судан IV (во портокалова боја) од глувци стари 20 недели, ја хранеле западната диета десет недели, визуелизирани заедно. Скала лента = 2 мм. Како контроли се користеа хумани глувци APOB100-трансгени Ldlr -/- (HuBL) и експерименталната група се состоеше од TCR-трансгенски глувци со LDL-реактивни Т-клетки (BT1) вкрстени за да формираат HuBL глувци. (Б.) Атеросклеротични лезии во аортниот лак (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; t-тест на Шилер). (Ц.) Атеросклеротични лезии во брахиоцефаличната артерија (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, Студентски тест). (Б.-Ц.) Точките претставуваат индивидуални глувци, лентите ја означуваат средната вредност "SEM. * P - 0,05". Оваа бројка е земена од Gistera et al. 32 сменети. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

Дополнителна слика 1: Алтернативна организација на слајдови за сериски делови на коренот на аортата. Поедноставена систематска организација на слајдови за собирање делови од коренот на аортата. Колекцијата овозможува боење на Oil Red O за липиди и имунохистохемија или боење со имунофлуоресценција. Специјалните слајдови за црвено боење на колаген во Пикросириус се изоставени. Кликнете тука за да ја преземете оваа датотека.

Дискусија

Откривање

Авторите немаат што да откријат.

Признанија

Им благодариме на сите поранешни членови на експерименталната единица за истражување на кардиоваскуларниот систем на Горан К Хансон, кои придонесоа за развојот на овој протокол во изминатиот четвртина век. Ние сме особено благодарни за придонесите на Антонино Николети, Ксингуа ouоу, Ана-Карин Робертсон и Ингер Бодин. Оваа работа беше поддржана со грантови за проекти 06816 и поддршка за Линеус 349-2007-8703 од Шведскиот истражувачки совет и грантови од Шведската фондација за срце и бели дробови, окружен совет во Стокхолм, фондација на професор Нана Сварц, Ло и Ханс Остерман. Фондација за медицински истражувања, Фондација за истражување на Каролинска институт и Фондација за геријатријални болести во Каролинска институт.