Малите некодирани РНК во регулаторот на двокомпонентен систем CiaRH во стрептокок
Малите некодирани РНК во регулаторот на двокомпонентен систем CiaRH во дисертација на Streptococcus pneumoniae од Dipl.-Biol. Одобрено од Одделот за биологија на Техничкиот универзитет во Кајзерслаутерн за доделување на академска диплома доктор на природни науки. Марта Ковач Претседател на докторскиот комитет: Проф. Матијас Хан Прв известувач: проф. Д-р. Реџин Хакенбек 2-ри известувач: проф. Д-р. A.он А. Калум Датум на научна дискусија: 8.05.2009 Кајзерслаутерн
Тековната работа беше спроведена во одделот за микробиологија на Одделот за биологија на Техничкиот универзитет во Кајзерслаутерн под раководство на проф. Реџин Хакенбек направи.
Со ова потврдувам, Марта Ковач, дека сам го подготвив сегашното дело. Ве уверувам дека сум користел само наведени извори и ресурси. Кајзерслаутерн, 17 март 2009 година
Содржина Содржина Страна Содржина 1 Резиме 5 Кратенки 7 1. Вовед 8 1.1 Streptococcus pneumoniae 8 1.2 Генетска компетентност и лиза на Streptococcus pneumoniae 10 1.3 Двокомпонентен систем CiaRH 13 1.4 Мали некодирани RNA 16 1.5 Цел на оваа работа 22 2. Материјал 23 2.1 Бактериски соеви 23 2.2 Плазмиди 25 2.3 Олигонуклеотиди 26 2.4 Културни медиуми 31 2.4.1 CpH8 медиум 31 2.4.2 THB медиум 32 2.4.3 D крвен агар 32 2.4.4 ЛБ медиум 33 2.4.5 2xTY медиум 33 2.5 Користени антибиотици 34 3. Методи 35 3.1 Микробиолошки методи 35 3.1.1 Документација за раст на бактериите 35 3.1.2 Услови за одгледување 35 3.1.3 Зачувување на вирусот 36 3.1.4 Микроскопија 36 3.1.5 Трансформација на Streptococcus pneumoniae 36 3.1.6 Тестирање на компетентност на Streptococcus . пневмонија 37 3.1.7 Трансформација на ешерихија коли 37 1
Содржина 4.10 Истражување на влијанието на одделните csrnas врз преводот на comc 144 5. Дискусија 146 5.1 Интергенетски промотори регулирани од CiaRH и нивни записници: 146 The csrnas 5.2 Стратегии за наоѓање на целните гени на csrna 148 5.3 Валидација на целите на csrna in vivo 150 5.4 на csrnas со mrnas на нивните целни гени 153 5.5 Однос помеѓу фенотипите поврзани со CiaRH 156 и csrnas 5.6 Слични ефекти и механизми во други организми 163 5.7 Outlook 165 6. Библиографија 167 4
1. Се чини дека воведувањето е вклучено во регулирањето на екстрацелуларните адхезини и на секретираните фактори на вирулентност (Крајкемајер и сор., 2001). Друга регулаторна РНК е локусот на карлицата.Овој локус е откриен со анализа на библиотека на транспозон и бил забележлив по својот плејотропен ефект врз експресијата на егзопротеините. Генот за РНК е долг 459 б.п., со понатамошен ген, сагата, е кодиран помеѓу позициите 147 до 308 б.п. Сепак, може да се покаже дека непреведената РНК, а не преведениот производ SagA, влијае на изразувањето на факторите на вирулентност (Манголд и сор., 2004). Третата позната мала РНК е RivX. Се чини дека оваа РНК е производ за обработка на преписот rivrx. Иако и овде има ORF на транскриптот, беше можно да се покаже дека РНК, а не протеинот има регулаторно дејство врз регулираните гени. Оваа РНК предизвикува позитивен ефект врз гените регулирани со Мга, што е важен регулатор на вирулентноста (Робертс и Скот, 2007). 21-ви
2. Материјал 2.4 Културен медиум 2.4.1 CpH8 медиум (C медиум) за културата на Streptococcus pneumoniae Во сите испитувања извршени во оваа работа, Streptococcus pneumoniae соеви се одгледувани во CpH8 медиум (Lacks & Hotchkiss, 1960). Индивидуалните компоненти на овој медиум се произведоа одделно и се пипетираа заедно само кога беше потребно. Индивидуалните компоненти се чуваа на 4 ° C со исклучување на светлината. Табела 2.17: Состав на медиум CpH8 Компонента Компонента [ml] PreC 400 Додаток 13 Глутамин [1 mg/ml] 10 Адамс III 10 Пируват 2% 5 фосфат пуфер 15 квасец екстракт 5% 9 Конечен волумен 462 Табела 2.18: Состав на одделните компоненти Компонента Дополнителна количина PreC Na ацетат, безводен 1,2 g казаминокиселини 5 g L-триптофан 5 mg L-цистеин 50 mg H 2 O и 1000 ml додаток прилагодуваат pH 7,5, автоклави 3in1 соли 60 ml глукоза 20% (без напојување) 120 ml сахароза 50% (во оптек) 6 ml аденозин [2 mg/ml] 120 ml уридин [2 mg/ml] 120 ml компоненти во автоклав индивидуално, пипете заедно под стерилни услови Adams III Adams I 160 ml Adams II 40 ml аспарагин 2 g холин хлорид 0, 2 g CaCl 2 [0,1 M] 1,6 ml H 2 O и 1000 ml стерилна филтрација и чувајте со исклучок на светлосен фоферат пуфер ph8 KH 2 PO 4 [1 M] 53 ml K 2 HPO 4 [1 M] 947 ml автоклав 31
2. Материјал 3ин1 соли Adams I Adams II MgCl 2 x6h 2 O 100 g CaCl 2, безводен 0,5 g MnSO 4 x4h 2 O [0,1 M] 0,2 ml H 2 O и 1000 ml автоклавирање Биотин 0, 5 g никотинска киселина 150 mg пиридоксин HCl 175 mg калциум пантотенат 600 mg тиамин HCl 160 mg рибофлавин 70 mg H 2 O и 1000 ml стерилен филтер и складирајте под исклучување на светлината FeSO 4 x7h 2 O 500 mg CuSO 4 x5h 2 O 500 mg ZnSO 4 x7h 2 O 500 mg MnCl 2 x4h 2 O 200 mg HCl конц. H 2 O 10 ml и 1000 ml стерилна филтрација и чувајте го со исклучок на светлина 2.4.2 Метод Тод-Хјуит (ТХБ) Методот Тод-Хјуит е комплексен медиум кој често се користи за пневмококи и е добиен готов за употреба (Дифко, Детроит, САД). Медиумот беше подготвен и автоклавен во согласност со упатствата на производителот. Табела 2.19: Состав на средството Тод-Хјуит Компонента Количина на говедско срце (инфузија на свежо ткиво) 3,1 g пептон 20 g глукоза 2 g NaCl 2 g натриум карбонат 2,5 g динатриум фосфат 0,4 g 2,4,3 D крвен агар Како цврст медиум за Култура на стрептококус пневмонија се користеше агар во крвта Д. За таа цел, Д-агар беше автоклавен и, по ладењето на 48 ° C, беше додадена дефибритрирана овча крв (Оксид) до крајна концентрација од 3% (v/v). По додавање на какви било адитиви, како што се антибиотици, смесата се меша и се става во стерилни садови Петри. 32
2. Материјал Табела 2.20: Состав на компонента Д крв агар екстракт од квасец глукоза бактопептон неопептон NaCl Tris агар H 2 O количина 1 g 10 g 5 g 1,25 g 5 g 1,25 g 15 g до 1000 ml 2,4,4 LB медиум Медиумот Лауриа-Бертани (ЛБ) беше искористен за култивирање на E. coli (Самбрук и сор., 1989). За да се произведе LB агар, 15 g/l агар беа додадени во медиумот. Се додадоа соодветни антибиотици и други адитиви по потреба. Табела 2.21: Состав на LB средина Компонента Компонента бактопептон 10 g NaCl 5 g екстракт од квасец 5 g H 2 O до 1000 ml 2,4,5 2xTY медиум 2xTY медиум беше искористен за изолација на помали количини на плазмид од E. coli. Табела 2.22: Состав на количината на компонента на медиум TY Бактопептон 16 g NaCl 5 g екстракт од квасец 5 g H 2 O до 1000 ml 33
2. Материјал 2.5 Користени антибиотици Антибиотиците сумирани во Табела 2.23 се додадени во цврстиот и течниот медиум по потреба. После нивната подготовка, берзанските раствори се филтрираат стерилно и се чуваат на -20 степени. Табела 2.23: Користен антибиотик Антибиотик растворувач Концентрација на залихи раствор Тетрациклин 50% EtOH 3 mg/ml 3 μg/ml Крајна концентрација Ампицилин H 2 O 20 mg/ml 100 μg/ml Спектоминоцин H 2 O 20 mg/ml 80 μg/ml Стрептомицин H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml еритромицин 90% EtOH 1 mg/ml 1 µg/ml канамицин H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml хлорамфеникол H 2 O 1 mg/ml 1 μg/ml 34
4. Резултати 1.0 Ефикасност на трансформацијата% 0,8 0,6 0,4 0,2 R6 RK12345 RK123 RK45 R6 ciar: aad9 0,0 0 20 40 60 80 100 120 Густина на ќелијата [NU] Слика 4.24: Ефикасноста на трансформацијата на различните ccn соеви на бришење во споредба со дивиот тип S. pneumoniae R6 и S. pneumoniae R6 ciar: aad9. Густината на клетките во единиците на нефело е прикажана на X-оската. Ефикасноста на трансформацијата во проценти (процентот на трансформирани клетки во бројот на живи микроби) е на Y-оската. Дивиот тип R6 е црна, RK12345 е црвена, RK123 е зелена, RK45 е темно сина и S. pneumoniae R6 ciar: aad9 е прикажан во светло сина боја. Резултатите од истрагата за природната трансформабилност на соевите RK12345, RK123 и RK45 укажуваат на врска помеѓу малите некодирани РНК и природната трансформабилност на S. pneumoniae R6. Сите три испитани соеви покажаа намалена трансформабилност. Овој фенотип не може да се забележи со R6 ciar: aad9. Единствено беше можно да се утврди промена во врв на компетентност во насока на пониски густини на клетките. Осумкратното намалување на трансформабилноста на сојот RK12345 е во спротивност со целосната трансформабилност на сојот со избришаниот циар. 105
4. Резултати 4.7.3 Одредување на активноста на ß-галактозидаза на целниот ген - фузиони протеини LacZ како функција на csrnas Активноста на целниот ген - лак фузиони протеини како функција на csrnas беше утврдена со анализа на ß-галактозидаза. За таа цел, плазмидите биле вметнати во геномот на дивиот тип S. pneumoniae R6 и csrna мутантот S. pneumoniae RK12345. Активноста на β-галактозидазата е измерена со употреба на лисати на цели клетки на соодветните соеви. Мерењата беа извршени во средната експоненцијална фаза со клеточна густина на Нефело 80 и кратко време по влегувањето во стационарната фаза. Резултатите од мерењата се прикажани на слика 4.30. R6 RK12345 20 T3comA 50 40 T3hsdS ß-Gal единици 15 10 5 ß-Gal единици 30 20 10 0 0 исте. Фаза статистика. Фаза истек. Фаза статистика. Фази Un-Гал единици 80 60 40 20 T3spr1610 ß-Gal единици 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 T3comC 1000 0 исте. Фаза статистика. Фаза 0 истек. Фаза статистика. Фаза 800 700 600 T3spr0081 8000 7000 6000 T3cibB ß-Gal единици 500 400 300 300 ß-Gal единици 5000 4000 3000 200 2000 100 1000 0 исте. Фаза статистика. Фаза 0 истек. Фаза статистика. Фаза 125
4. Резултати 700 600 T3spr0231 200 180 160 T3blpY ß-Gal единици 500 400 300 200 100 ß-Gal единици 140 120 100 80 60 40 20 0 исте. Фаза статистика. Фаза 0 истек. Фаза статистика. Фаза ß-Гал единици 400 350 300 250 200 150 T3spr0822 ß-Гал единици 50 40 30 20 T3spr1932 100 50 10 0 0 исте. Фаза статистика. Фаза истек. Фаза статистика. Фаза 20 T3spr0265 80 T3spr1645 15 60 ß-Gal единици 10 ß-Gal единици 40 5 20 0 исте. Фаза статистика. Фаза 0 истек. Фаза статистика. Фаза 1000 800 PvegT ß-Gal единици 600 400 R6 RK12345 200 0 исте. Фаза статистика. Фаза Слика 4.30: Активности на β-галактозидаза на 12 клонирани целни гени - лак фузиони протеини во див тип S. pneumoniae R6 и S. pneumoniae RK12345. Мерењата беа извршени во две точки на време: во експоненцијална фаза со клеточна густина од Нефело 80 и кратко време по влегување во стационарна фаза. Единиците се дефинираат како nmol ослободен ONP/min/mg протеин. Прикажани се средствата за најмалку 2 независни експерименти. Активностите на целниот ген - лак фузиони протеини во C медиум се прикажани во црно за S. pneumoniae R6 и црвено за S. pneumoniae RK12345. Како контрола, активноста на промоторот на P vegt беше утврдена во двата соја. 126
4. Резултати Слика 4.39: Анализи за промена на опсегот и анализа на Northern blot на интеракциите на комплексите на comc-rna и csrna3. Сликите погоре ги прикажуваат гелите за менување на лентите со дамки во SYBRGreenII. Вчитувањето на гелот е како што е претходно опишано. Лентите за интеракција се обележани со црвени стрели. На сликите подолу се гледаат размачканите гелови. На левата слика, беше откриена сонда специфична за csrna3. На вистинската слика, мембраната беше пресечена и комбестирана. користени специфични htra сонди. Избришаните ленти за интеракција се обележани со црвени стрели. Анализа на интеракција со spr0081 Анализата на интеракција е извршена со сите 5 csrnas. Јасни ленти за интеракција може да се детектираат во csrna2, csrna3, csrna4 и csrna5. Во исто време, на овие патеки може да се забележи исчезнување на spr0081-rna на нејзината вистинска висина на одење. Не можеше да се видат јасни ленти за интеракција во csrna1 и опсегот spr0081 не се смени. Така, spr0081-rna не формира комплекс на интеракција со csrna1. И тука csrna1 формираше ленти со приближно двојно поголема висина (Слика 4.40, лента 5). Овие опсези беа видени и на последните траги од негативната контрола. 142
5. Дискусија 5. Дискусија 5.1 Интергените промотори регулирани од CiaRH и нивните записници: Csrnas Интергените промотори регулирани со CiaRH се силно зависни од CiaR. Без функционален регулатор на одговор, практично нема израз (Halfmann et al., 2007). Активностите на овие промотори се прикажани во Табела 5.1. Табела 5.1: Активности на β-галактозидаза кои произлегуваат од CiaRH-регулираните интергени промотори Промотори R6 ciar: aad9 R6 (wt) R6 ciaht230p P ccnc