Нов потенцијал за вакцинација на rv3131, наводна нитроредуктаза кодирана со доср-регулун, против
предмети
апстрактен
вовед
Во оваа студија, ја испитавме имуногеноста и заштитните ефекти на Rv3131 формулирани во GLA-SE (Glucopyranosyl Lipid Adjuvant Stable Emulsion), добро дефиниран TLR4 адјувант, како платформа за вакцини за под-единици против хипервирулентно Mtb K изложеност.
Резултати
Преписот rv3131 е регулиран во експоненцијална фаза на раст, во хипоксична состојба и во макрофаги, без оглед на фазата на раст во вирулентниот изолат на Mtb
38 kDa од Rv3131 се потврдени со електрофореза на натриумодецил сулфат-полиакриламид гел (SDS-PAGE) и Western blot (1c).
( а ) Нивото на изразување на rv3131 е оценето со употреба на qRT-PCR. Различните промени на преклопувањето помеѓу Mtb H37Rv (светло сива лента) и Mtb K (темно сива лента) под различни услови на раст, експоненцијална фаза и услови на хипоксична култура беа утврдени со методот ΔΔCt, а изразот 16 S rRNA беше искористен како ендогена контрола. Rv3133c (dosR) се користеше како позитивна контрола. ( б ) QRT-PCR беше исто така користен за rv3131 експресија на Mtb во рамките на BMDM. Различните промени на преклопувањето помеѓу Mtb H37Rv (светло сива лента) и Mtb K (темно сива лента) се утврдени со методот ΔΔCt и изразот 16 S rRNA бил користен како ендогена контрола. Rv3133c (dosR) се користеше како позитивна контрола. ( в ) Coomassie blue обои 10% SDS-PAGE со рекомбинантен Rv3131 протеин (лев панел), прочистен во услови без ендотоксин и потврден со Western blot со антихистидинско антитело (десен панел). М: стандарден маркер за молекуларна тежина.
Имуногеност и имунолошка меморија предизвикана од имунизација Rv3131
Секоја група глувци беше имунизирана и еутанизирана како што е опишано во делот Методи. Четири недели по последната имунизација, глувците во секоја група беа жртвувани и нивните клетки на белите дробови и слезината беа третирани со Rv3131 (5 μg/ml) на 37 ° C за 12 часа во присуство на Golgi Stop. ( а ) Стратегијата за порти што се користи за идентификување на специфични за популации на мултифункционални Т-клетки на Ag. ( б ) Кога се стимулираат со вакцината Rv3131 Ag, процентите на специфични за Ag, мултифункционални CD4 + CD62L и CD8 + CD62L Т-клетки кои произведуваат TNF- & agr;, IFN- & ggr; и/или производство на IL-2 во клетките на белите дробови и слезината од секоја имунизирана група беа проценети со употреба на проточна цитометрија. Средните фреквенции на клетките кои произведуваат ефективни цитокини се прикажани како графикони со пити. Резултатите се изразени како средна ± SD за 5 глувци од секоја група. Значењето на разликите беше утврдено со непарен т-тест. П-вредност
Покрај тоа, обемната генетска варијација може да доведе до промена на ефикасноста на вакцините и патеки на експресија на гени кои се важни за развојот на вакцината против ТБ. На пример, Коен и сор. предвидува дека некомплетното разбирање на разновидноста на микобактериските соеви може да има значително негативно влијание врз ефективноста на вакцините бидејќи вакцината ги заменува ненасочените варијанти на Mtb со видот 38. Покрај тоа, Хомолка и сор. сугерираше дека генетската разновидност во соединенијата Mtb ја зајакнува потребата за решавање на предизвикот за користење на различни видови Mtb како заеднички чекор во тестирањето на вакцините и тестирањето на лекови 39 .
Затоа претпоставивме дека клинички доминантен генотип Mtb и преекспресирани Ags специфични за вирусот може да бидат добри целни вакцини Ags. Конечно, со анализа на микро-низа на транскрипти на гени, идентификувавме дека Rv3131 го исполнува горенаведениот стандард меѓу гените кодирани со DosR регулуон. Според наши сознанија, ова е прв пат DosR регулаторот поврзан со Rv3131 да биде ефикасен против предизвикот со високо вирулентен клинички вид Mtb од Пекинг.
Во оваа студија испитавме дали Rv3131 произведува Ag-специфичен IFN-γ за време на Mtb K инфекција. -Реакција (2а) и каков тип на одговор на Т-клетките е предизвикана од вакцинација со Rv3131 и GLA-SE (2, 3 и 4) 5) пред и по предизвикот. Нашата студија покажа дека Rv3131 предизвика Аг-специфичен IFN-γ одговор за време на инфекцијата со Mtb K и дека вакцинацијата со Rv3131 и GLA-SE предизвика силна реакција на Т-клетките на меморијата специфична за Ag. Покрај тоа, вакцината против под-единицата Rv3131 предизвика робустен и одржлив мемориски одговор базиран на Th1 (сл. 2, 3 и 5) и споредлив заштитен ефект против Mtb K за разлика од заштитата предизвикана од BCG како вакцинација против единечна Ag под-единица 4 Недели по вакцинирањето. Инфекција (слика 4).
Неодамна, Зви и сор. објавија дека 189 гени од 3.989 производи ОРФ на геномот Mtb се избрани во силициум диоксид како кандидати за наводни вакцини врз основа на базата на податоци во размер на геном, создадени преку обемно ископување податоци и биоинформатика 44. Меѓу 189 кандидати за вакцини, Rv3131 и Rv3127, друг DosR регуларно-кодиран нитроредуказа и вториот највисок ген во нашата студија за профил на транскрипција беа вклучени во списокот со 45 врвни хитови. Покрај теоретската анализа, експерименталните докази покажуваат дека Rv3131 е Т-клетка Ag. На пример, пријавени се Rv3131, Mtb-специфични имунолошки реакции на Т-клетки, кај позитивни субјекти на кожата со туберкулински тест, но не и кај здрави контроли или пациенти со ТБ 45. Како друг пример, Rv3131 покажа најимуноген Ag потенцијал кога ќе се спореди со другите DosR-поврзани Ags тестирани за нивната способност да предизвикаат IFN-γ кај латентно заразено население на Гамбија 46 .
Сумирајќи, нашите сегашни податоци укажуваат на тоа дека DosR-кодираниот Rv3131, нова цел Ag за развој на вакцини против ТБ, има потенцијал како ефективна вакцина Ag со исполнување на следниве критериуми: конститутивен и стабилен израз во хипервирулентен пекиншки Mtb; способност да се препознае од имунолошкиот систем за време на ин виво инфекција; можност за индуцирање на Ag-специфични, Th1-пристрасни мултифункционални Т-клетки; и ефикасност против хипер-вирулентни Mtb соеви. Затоа, Rv3131 може да биде одличен кандидат за употреба во вакцина со повеќе антигени Mtb под-единица, особено со оглед на ограничената ефикасност на вакцината BCG против семејството Пекинг.
Методи
Ивотни
Сите експерименти врз животни беа извршени според упатствата и прописите на Корејската администрација за храна и лекови (KFDA). Експерименталните протоколи беа разгледани и одобрени од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни (број на дозвола: 2015-0041) на здравствениот систем на универзитетот Јонсеи (Сеул, Кореја). По одобрување на испитувањата, женските глувци C57BL/6 без патогени (SPF) глувци на возраст од 6-7 недели беа купени од Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Јапонија) и се сместени под услови на бариера во објект BSL-3 во Avison Biomedical Research Центар на медицинскиот колеџ Јонсеи.
Бактериски соеви и производство на бактериска РНК
Експерименти и анализи со микро-низа
Слајдовите на Mtb oligoarray беа kindубезно обезбедени од Др. Стефан Н.Е. Кауфман (Институт за инфекција биологија Макс Планк, Берлин, Германија). Означувањето на РНК и хибридизацијата на низата беа извршени како што е претходно опишано 59. Хибридизираните слајдови беа скенирани со GenePix 4000B скенер за микро-низа (Axon Instruments, CA, САД) и интензитетот на самото место беше идентификуван и квантифициран со TM4 Microarray Software Suite (//www.tm4.org). Интензитетите на точките на сигналот беа нормализирани во MIDAS користејќи ги опциите за алгоритам LOWESS и вкупниот интензитет на полето. За статистичката анализа се користени четири биолошки реплицирани низи за експоненцијални услови за раст и три биолошки реплика за услови на хипоксична култура.
Генерација на BMDM и ин витро инфекција
BMDM се генерирани како што е претходно опишано 61. По 6 дена, диференцираните BMDM беа заразени со Mtb H37Rv и K на МВР од 10 во текот на 24 часа.
Потврда на изразот на rv3131 со qRT-PCR
Вкупните Mtb H37Rv и K-RNA беа извлечени од експоненцијалната фаза на раст под хипоксија и МТБ инфицирани со МТБ со употреба на Тризол како што е опишано погоре. Потоа, cDNA беше синтетизирана со користење на RT & GO мастер мешавина (MP Biomedicals, Германија) според препораките на добавувачот. После синтезата, диференцијалниот ген израз помеѓу Mtb H37Rv и K беше измерен со помош на qRT-PCR како што е претходно опишано 62. Накратко, qRT-PCR беше извршен на систем за реално време StepOnePlus PC (Applied Biosystems, CA, САД) со помош на SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara Bio Inc., Shiga, Јапонија). qRT-PCR беше извршена со користење на следниве групи на прајмери; rv3131 напред, 5'-GTGCCCTAGACCGAATGAAA-3 'и назад, 5'-TAGCGCCCACTCCAAATG-3', dosR (rv3133c) напред, 5'-AGACATCAAGGGAATGGAGTTG-3 'и назад, 5'-TGGTCGTCGAGGAGAGTAGGACGAGGACGAGAGAGGACGAGAGGTACGAGAGGACGAGGTACGAGAGGTACGAGAGGTACGACAGAGGTACGAGAGGTACGAGAGGTACGAGAGGTACGAGAGGTACGAGAGGTACGAGAGGTAGGAGAGTTAG-3' и назад 3 'и назад, 5'-CGGGACTTAACCCAACATCTC-3'. Промената на преклопот во изразот на гените помеѓу Mtb H37Rv и Mtb K е пресметана со методот ΔΔCt и 16S rRNA е искористена за нормализирање. За статистичка анализа беа користени три биолошки реплики.
Изразување и прочистување на рекомбинантен Rv3131 протеин
Имунизација на глувци
Ц57БЛ/6 глувци биле имунизирани со три интрамускулни инјекции, со растојание од три недели. Секоја имунизација содржеше 5 μg рекомбинантен протеин Rv3131 со 5 μg GLA-SE (додаток на глукопиранозил липид) формулиран во стабилна емулзија масло во вода (SE) од IDRI (Институт за истражување на заразни болести). GLA-SE беше providedубезно обезбедена од ИДРИ (Сиетл, В.А., САД). За имунизација на BCG, глувците биле инјектирани поткожно со 2 × 10 5 CFU BCG Pasteur 1173P2. Контролната група на глувци беше имунизирана само со GLA-SE. Клетките на слезината и белите дробови беа собрани и користени за анализа на имуногеност 4 недели по последната имунизација.
Mtb инфекција
Четири недели по последната имунизација, контролната адјуванса (GLA-SE) и вакцинираните глувци (BCG, Rv3131/GLA-SE) беа аерогени заразени со сојот Mtb K како што е претходно опишано 63. Накратко, глувците биле изложени на Mtb K 60 минути во комората за вдишување на уред за инфекција на воздухот (Глас-Кол, Тере Хауте, ИН) калибриран за да се даде предодредена доза. За да се потврди првичното оптоварување на бактериите, четири глувци беа еутаназирани еден ден подоцна и приближно 150 одржливи бактерии беа ослободени во белите дробови на секој глушец.
Мерење на цитокини
Единечни клетки подготвени од слезината и белите дробови на инфицирани или имунизирани глувци од Мтб беа стимулирани со Rv3131 (5 μg/ml) или PPD (2 μg/ml) 24 часа на 37 ° C. ППД беше kindубезно обезбедена од д-р. Бренан во Аерас (Роквил, М.Д., САД). Нивоата на секретиран IFN-γ (eBioscience, Сан Диего, Калифорнија), IL-4 и IL-5 (BD Bioscience, Сан Диего, Калифорнија) во супернатантот на културата се откриени со употреба на комерцијален комплет ELISA според упатствата на производителот.
Титар на антитела во серумот
Реакциите специфични за Rv3131 IgG1 и IgG2c во серумот се оценети како што е претходно опишано 63. Накратко, плочите со 96 бунари беа исполнети со 2. g/ml Rv3131 обложена; Конјугирано антитело на рен пероксидаза (HRP) против IgG1 (BD Bioscience, Сан Диего, Калифорнија) или IgG2c (Јужен биотехника, Бирмингем, АЛ) беше користено како секундарно антитело. Оптичките густини (ОД) се утврдени на 495 nm во рок од 15 минути по завршувањето на реакцијата.
Анализа на подпопулации на Т-клетките
Суспензии на единечни клетки на клетките на белите дробови и слезината беа подготвени како што е претходно опишано 65. Суспензиите на единечните клетки прво беа блокирани со анти-ЦД16/32 за 15 минути на 4 ° С. Откако површината на клетката беше обложена со Аква-мртва клетка-комплет за фиксирање LIVE/DEAD ((ThermoFisher Scientific, Валтем, М.А., САД), Брилијантен Виолетова 421 (BV421) -конјугиран анти-ЦД3 и epsi; -Перидинин-хлорофил (PerCP) -Cy5,5-конјугиран анти-ЦД4, алофикоцијанин (АПЦ) -Ци7-конјугиран анти-ЦД8 (БД Биосценс, Сан Диего, Калифорнија), фикоеритрин (ПЕ) -конјугиран анти-ЦД44, АПЦ конјугиран анти-ЦД127 и флуоресцеин изотиоцијанат (FITC) конјугиран анти-ЦД62Л (eBioscience, Сан Диего, Калифорнија) антитело 30 минути на 4 ° C, сметајќи го секој вид мемориска Т-клетка користејќи FACSVerse- Анализирани проток-цитометри (BD Biosciences) и комерцијално достапен софтвер (FlowJo).
Интрацелуларно боење со цитокини
Суспензии на единечни клетки на имунизирани и заразени глувци (2 × 10 6 клетки) беа стимулирани со Rv3131 (5 μg/ml) или PPD (2 μg/ml) на 37 ° C за 12 часа во присуство на GolgiStop (BD Bioscience). Клетките прво беа измиени со PBS, блокирани со анти-CD16/32 блокирачки антитела на 4 ° C за 15 минути и потоа беа обоени со антитела обележани со флуорохром против CD3, CD4, CD8 и CD62L, како и со LIVE/DEAD TM Fixable Aqua Dead Комплет за клетки 30 минути на 4 ° C. Како негативни контроли, клетките беа обоени во површина со соодветен изотип - имуноглобулин (Ig). Клетките се мијат со Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) 30 минути на 4 ° C, фиксирани и пермеабилизирани. Клетките беа измиени двапати со Перм/миење (BD Biosciences) и потоа се обоени интрацелуларно со APC-конјугиран анти-TNF-α, PE-конјугиран анти-IFN-γ и PE-Cy7-конјугиран анти-IL-2 (BD биолошки науки) за 30 мин на 4 ° С. Клетките се мијат со Перм/Измијте и потоа се фиксираат со тампон за фиксирање на IC (еБиосвет). Откако повторно беа суспендирани во PBS, клетките беа анализирани со помош на проток на цитометар.
Набројување на бактерии и хистопатолошка анализа
Статистичка анализа
Сите in vitro резултати се репрезентативни на најмалку три независни експерименти со конзистентни резултати. Податоците на графиконите се претставени како средна ± стандардна девијација (SD). Податоците од in vivo експериментот се пријавени како средна вредност со интерквартилен опсег (IQR). Споредбите помеѓу примероците беа направени со користење на непарен т-тест или еднонасочна ANOVA проследено со повеќекратно тест за споредба на Туки кога податоците беа дистрибуирани вообичаено со употреба на Prism 5 (GraphPad Software верзија 5, Сан Диего, Калифорнија).
дополнителни информации
Како да го цитирате овој напис: Квон, КВ и сор. Нов потенцијал за вакцинирање на Rv3131, наводна нитроредуказа кодирана со DosR регулалон, против хипер-вирулентен сој на Mycobacterium tuberculosis K. Sci. Реп. 7-ми, 44151; дои: 10.1038/srep44151 (2017).
Белешка на уредникот: Springer Nature останува неутрален во однос на побарувањата за надлежност во објавените мапи и институционалните врски.
Понатамошна информација
Документи со зборови
Понатамошна информација
Забелешки
Со поднесување коментар, вие се согласувате со нашите услови за користење и упатствата за заедницата. Ако најдете нешто навредливо или што не е во согласност со нашите услови или упатства, означете го како несоодветно.