Од Институтот за сточарство и размножување Универзитет во Хоенхајм, Одделение за сточарство и

Од Институтот за сточарство и размножување Универзитет во Хоенхајм Предметна област: Сточарство и физиологија на изведба Проф. Р.Клаус Зголемување на формирањето на бутират со хранење отпорен скроб кај свињите: Последици за регулирање на митозата и апоптозата на мукозата на дебелото црево Дисертација за добивање на степен доктор на земјоделски науки презентирана на Факултетот за земјоделски науки од Јоаким Ментшел од Ландшут 2004

Тековната работа беше прифатена на 12 март 2004 година од Факултетот за земјоделски науки на Универзитетот во Хоенхајм како дисертација за добивање на диплома доктор на земјоделски науки. Ден на усниот испит: 25 март 2004 година Прв продекан: проф. Д-р. K. Stahr Известувач, 1-ви испитувач: Проф. Др. Р.Клаус Ко-известител, 2-ри испитувач: проф. Х. Шенкел 3-ти испитувач: проф. Д-р. R. Mosenthin

Преглед на литература 2 Преглед на литература 2.1 Преглед на дигестивниот систем на свињата Дигестивниот систем на свињата е поделен на главата и трупот. Цревата на главата се состои од носни, орални и фарингеални шуплини. Багажникот може да се подели на предниот дел од цревата (хранопроводот и желудникот), средното или тенкото црево (дуоденум, јејунум и илеум), ректумот или дебелото црево (цревата, дебелото црево и ректумот) и анусот (Либич, 1998). Структурата на цревото на трупот е прикажано шематски на слика 1. Сл. 1: Шематски приказ на трупот на трупот кај свињите (по Кох и Берг, 1990) 2I

Преглед на литературата Должината на целото црево кај свињите е 20-27 м, околу 15 пати поголема од должината на телото. Дуоденумот се мери приближно 0,95 м и целото тенкото црево со јејунум и илеум приближно 15-20 м. Должината на дебелото црево е околу 6 m, онаа на дебелото црево околу 5 m (Loeffler, 1991; Bucher & Wartenberg, 1991). 2.1.1 Морфолошки принципи на гастроинтестиналниот тракт и неговите посебни карактеристики Сите делови на трупот на трупот имаат сличен основен план (Liebich, 1998), но има значителни разлики во однос на нивната структура на wallидот (слика 2). Тенкото црево се состои од бројни крипти и ресички. Криптите се пократки од оние на дебелото црево. Спротивно на тоа, цревните ресички се отсутни во дебелото црево. Карактеристично е формирањето крипти (жлезди на цревата), тие се неразгранети и блиску една до друга. Сопствените дигестивни ензими не се излачуваат од мукозата на дебелото црево. Понатаму, дебелото црево има способност да излачува слабо растворливи материи како метали. Покрај тоа, за разлика од тенкото црево, не само перисталтичките, туку и антиперисталтичките движења се физиолошки во дебелото црево (Bucher & Wartenberg, 1991). Сл. 2: Различни wallидни структури на тенкото црево и дебелото црево (по Потен, 1992) 3

Преглед на литература 2.1.2 Морфолошки особености на дебелото црево Дебелото црево се развива за време на ембриогенезата од средниот и ректумот. Асцендентниот колон и проксималниот попречен дебело црево се развиваат од средното црево, а дисталниот попречен дебелото црево и опаѓачкиот дебелото црево произлегуваат од ректумот. Покрај овој различен развој, постојат и дигестивни физиолошки разлики, така што главното место на ферментација е во проксималната област, но исто така може да се помести дистално во зависност од зафатената подлога. Понатаму, дигестивната пулпа сè повеќе се згуснува во дисталната област. Од овие причини, дебелото црево се нарекува проксимален и дистален дебело црево во овој труд. Проксималниот дел се состои од асценденција на дебелото црево и проксималната област на попречното дебело црево, дисталното подрачје на дисталниот попречен дебелото црево и опаѓачкото црево. 2.1.2.1 Општа конструкција на wallидот на дебелото црево Основниот градежен план на дебелото црево се состои од разни слоевити ткива (Слика 3); од луменот кон надвор, тие се нарекуваат туника мукоза, теле подмукоза, туника мускуларис, тела субсероза и туника сероза. Сл. 3: Пресек низ дебелото црево (Либич, 1998) 4I

Преглед на литературата 2.2 Задачи на гастроинтестиналниот тракт Примарна задача на гастроинтестиналниот тракт е да ја разгради проголтаната храна во нејзините компоненти до тој степен што може да се апсорбира во внатрешноста на телото. Дигестивниот процес започнува со механичко распаѓање на компонентите на храната во усната шуплина. По голтањето на храната, јагленохидратите, протеините и мастите се варат. Варењето на храната во средното црево се одвива преку ензими. Преглед на сопствените ензими на организмот при распаѓање на главните хранливи материи е даден на Сл. 5. Сл. 5: Преглед на сопствените ензими на организмот за време на распаѓањето на главните хранливи материи (според Симон, 1995) Ефективноста на ензимите на тенкото црево во дебелото црево се намалува континуирано. Наместо тоа, цревните бактерии и протозои кои ги распаѓаат јаглените хидрати и протеините, го преземаат варењето на преостанатите компоненти на храната во дебелото црево. Покрај апсорпцијата на минерали и вода, задачите на дебелото црево се синтеза на витамини Б и К и главно 7

Преглед на литературата Таб. 3: Моларни стапки на ацетат, пропионат и бутират по 24 часа инкубација на човечки измет со различни јаглехидрати (според Камингс и Макфарлан, 1997) Принос на подлогата на SCFA (%) Моларни стапки (%) ацетат пропионат бутират скроб 49 62 15 23 трици (пченица, 40 64 16 20 овес) фруктоолигосакарид - 78 14 8 пектини 39 80 12 8 други NSP 38 63 22 8 вклучувајќи: гума за џвакање арабиногалактан 62 43 59 57 27 31 11 11 компоненти на храна како целулоза, хемицелулози, пентозани (Берггрен и al., 1993; Bourquin et al., 1993; Knudsen et al., 1993) доведуваат до мала ферментација на бутират, додека се постигнуваат зголемени концентрации на бутират, особено со отпорни скроб. Таб. 4: Моларни стапки на ацетат, пропионат и бутират по 24 часа инкубација на измет од свињи со различен скроб (според Мартин и сор., 1998) Моларен сооднос на подлогата (%) ацетат пропионат бутират суров пченичен скроб 56 25 17 суров пченкарен скроб 62 21 16 суров скроб од грашок 62 21 15 суров амилома пченкарен скроб 47 28 23 ретрограден 54 28 14 амилома пченкарен скроб суров компиров скроб 55 19 25 11

Преглед на литературата за одржување на ткивна хомеостаза. Тоа е тесно поврзано со митозата, бидејќи ако бројот на клетки во ткивото остане ист, се формираат многу клетки колку што се губат преку клеточна смрт (Кер и сор., 1972). Соодветно на тоа, добро дефинирани механизми за регулирање на загубата на клетките мора да постојат во ткива со постојано производство на клетки (Ansari & Hall, 1992). Нивните задачи се да отстранат излишни, оштетени или заразени клетки (Томпсон, 1995). Грешките во апоптозата можат да доведат до разни клинички слики. Ако митотичната стапка остане иста, зголемувањето доведува до атрофија на ткивото. Од една страна, активирањето на про-апоптотичните контролни механизми може да доведе до дегенерација на ткивата (Que & Gores, 1997), од друга страна, грешките во апоптозата ја олеснуваат трансформацијата на нормалното ткиво во неопластично ткиво. Од овие причини, се дискутира за фармаколошките стратегии во врска со влијанието врз апоптозата. Така, инхибицијата на апоптозата на епителните клетки може да ги подобри обновата на ткивата и да ги поправи процесите во гастроинтестиналниот тракт, додека индукцијата на апоптозата во малигните ткива може да има голема терапевтска корист (Que & Gores, 1997). 2.4.1 Клеточна делба: Митоза Процесот на клеточна делба, преку кој се создава нова клетка со ист број на хромозоми како и во оригиналната клетка, се нарекува митоза. При митоза, секој хромозом се дели на два еднакви делови што патуваат на спротивните краеви на клетката. По поделбата на клетките, секоја од двете ќерки клетки тогаш има ист број на хромозоми и гени како и оригиналната клетка. Едноставно изградените едноклеточни клетки и некои повеќеклеточни видови се размножуваат преку митоза; Покрај тоа, живите суштества растат преку овој процес (хиперплазија) и користените клетки се заменуваат. Ова е во спротивност со растот на клетките (хипертрофија), што треба да се сфати само како зголемување на масата на клетките или големината на клетките. Во мукозата на гастроинтестиналниот тракт, ентероцитите секогаш излегуваат од матичните клетки кои се наоѓаат во долните области на криптата (Бах и сор., 2000). Со цел да се идентификува клетката што се размножува, мора да се детектираат специфични промени, како што се генски производи кои се поврзани со пролиферација. Претставници на овие гени поврзани со пролиферацијата вклучуваат: дискутираше за онкогените. Хронолошкиот клеточен циклус (слика 7) е од големо значење за идентификување на митозата. Ова е поделено во четири фази (G1, S, G2 и M). За време на S Pha- 14 I

Прегледот на литературата се одвива во синтезата на ДНК, за време на митозата во М фаза со поделбата на хромозомите. Во фазите G1 и G2 (фази на празнини), се прават подготовките за процесите во следните фази S и M. Клетките кои не поминуваат низ клеточниот циклус се во фаза Г0. Почеток на митоза MR G2 G0 G1 S Почеток на синтеза на ДНК Сл. 7: Шематски приказ на клеточниот циклус Откривањето на митозата може да се утврди со употреба на одредени маркери како што се PCNA (нуклеарен антиген на размножување на клетките) и откривање на нуклеарен антиген (Ki67) (Potten & Лофлер, 1990). PCNA протеинот се синтетизира во клетките што делат. Антителата насочени против овој протеин реагираат со клетки што делат, вклучувајќи туморски клетки, но не и со клетки во фаза на мирување (Mathews et al. 1984). Антителото Ки67 детектира нуклеарен антиген кој е присутен во клетките што се размножуваат, но не и во клетките во мирување. Клетките во циклични фази, вклучително и G1, се Ki67 позитивни, додека клетките во G0 фазата не го изразуваат антигенот (Baisch & Gerdes 1990). 15-ти

Преглед на литературата Сл. 10: Шематски приказ на апоптозата (според Кер, 1993) 2.4.4.2 Текот на апоптозата Апоптозата може да се започне со употреба на разни контролни механизми (Слика 11). Во овој контекст, мора да се направи разлика помеѓу патот на апоптозата со посредство на рецепторот и митохондријалниот пат. 21-ви

Преглед на литературата Патот на апоптозата со посредство на рецепторите се започнува преку рецептори како што е ЦД95. Врзувањето на CD95 лиганд со CD95 го индуцира сигналниот комплекс, кој регрутира молекули на прокаспаза 8 со помош на FADD (Fas асоциран протеин на доменот на смртта) и затоа е одговорен за активирање на каспаза 8 (Хенгартнер, 2000). Митохондриите играат централна улога во контролата на апоптозата. Митохондријалниот пат може да биде активиран од вонклеточни фактори или оштетување на ДНК. Протеините од семејството Бкл-2 се вклучени во овој регулаторен механизам. Про- и анти-апоптотичните претставници на ова семејство стапуваат во контакт во митохондриите и го контролираат ослободувањето на разни молекули како што е цитохром в, кој заедно со Апаф-1 и Прокаспаза 9 може да ги активираат кафеите на ефектот. Понатамошните детални механизми прикажани на дијаграмот не се дискутирани понатаму во оваа работа; подетални објаснувања може да се најдат во публикацијата од Хенгартнер (2000). Сл. 11: Шема на најважните патеки на апоптозата (лево: патека на апоптоза со посредство на рецептори; десно: патека на митохондријална апоптоза, според Хенгартнер, 2000) 22 I.

Преглед на литературата Членови на семејството bcl-2 ослободување на митохондрион цитохром c Активирање на каскадата касказа Апоптоза Сл. 12: Модел на каскадата на апоптозата преку Bcl-2, митохондрија, цитохром c и каскази 2.4.5.1 Апоптоза регулирање на протеини: Bcl-2 семејство Bcl-2 се користеше идентификувани. Генот првпат беше откриен во лимфом на Б-клетки. Експериментите врз глувските клеточни линии, исто така, покажаа ефект на bcl-2 врз апоптозата (Vaux et al., 1988). Додека Bcl-2 се наоѓа во многу фетални ткива, кај возрасните ткива, овој протеин главно се изразува во брзо разделувачките и диференцирачките клетки. Во понатамошните истражувања, пронајдени се бројни гени кои имаат низа хомологии со bcl-2 (Јанг & Корсмајер, 1996; Рид, 1997). Карактеризацијата на низата аминокиселини, биолошкиот ефект и функцијата доведоа до разни наб variousудувања. Соодветно на тоа, семејството на протеини Bcl-2 ги вклучува и Ver 25

Преглед на литературата Bcl-2, Bcl-X-L, Bid или сами (Sattler et al., 1997). Бакс се спротивставува на анти-апоптотичниот протеин Bcl-2; колку е поголема концентрацијата на Бакс во споредба со Bcl-2, толку е поголем неговиот ефект. Релативните стапки на хомодимери на Бакс/Бакс, хетеродимери на Бкл-2/Бакс и хомодимери на Бкл-2/Бкл-2 се клучни за извршување на апоптозата. Ако преовладуваат хомодимери на Бакс, тогаш настанува смрт на клетките; преовладувањето на хекродемерите на Bax/Bcl-2 има тенденција да доведе до опстанок на клетките (Сато и сор., 1994). Сепак, исто така, се покажа во некои студии дека, без оглед на степенот на димеризација, Bcl-2 и Bcl-x можат да ја инхибираат апоптозата или дека Бакс исто така може да промовира апоптоза (St Clair et al., 1997; Zha & Reed, 1997) (Слика 13). Покрај тоа, се чини дека проапптотичниот ефект на Бак е независен од хетеродемеризацијата со Bcl-X-L и Bcl-2 (Симониан и сор., 1997). a: bax bcl-2 bcl-2 bax b: Слика 13: Дијаграми кои ја прикажуваат протеин-протеинската интеракција на членовите на семејството bcl-2 (a: изменето од Mathers, 1998; b: Sato et al., 1994) 27