Од медицинската клиника со фокус на хематологија, онкологија и тумор имунологија - PDF
Од Медицинската клиника со фокус на хематологија, онкологија и туморна имунологија на Медицинскиот факултет Харите универзитетсмидизин БИРН ДИСЕРСТАЦИЈА Онекогено-индуцирана стареење во колосек аденом-карцином низа и неговата функција како предиктор за одговор на 5-FU во примарно метастатската ситуација за академска диплома Доктор лекови (д-р. Медицина) презентирани на Медицинскиот факултет Charité Universitätsmedizin Berlin од Ања Хаугстетер од Штутгарт-Бад Канстат
Рецензент: 1. Проф. медицински C. A. Schmitt 2. Проф. Др. медицински F. R. Greten 3. Проф. Др. медицински L. Zender Датум на д-р: 18 ноември 2011 година 2
Содржина 1 Вовед 6 1.1 Колоректален аденокарцином 6 1.1.1 Епидемиологија на колоректален аденокарцином 6 1.1.2 Фактори на ризик за развој на колоректален карцином 6 1.1.3 Прогностички релевантни фактори 7 1.1.4 Секвенца на карцином на аденом 8 1.1.5 Онкогенот 10 6 Терапија на колоректален аденокарцином 11 1.2 Апоптоза 11 1.3 Стареење 12 1.3.1 Карактеристики на стареење 13 1.3.2 Потенцијални маркери за стареење 15 1.3.3 Значење на стареење предизвикана од онкогена in vivo 18 1.3.4 Предвремена стареење и хемотерапевтски агенси 19 2 Истражувачко прашање 22 3 Материјал и методи 23 3.1 Материјал 23 3.1.1 Клеточни линии и бактериска линија 23 3.1.2 Медиуми 23 3.1.3 Решенија 24 3.1.4 Плазмиди 25 3.1.5 Уреди и додатоци 25 3.1.6 Антитела 27 3
3.2 Методи 28 3.2.1 Клеточна култура 29 3.2.1.1 Клеточни линии 29 3.2.1.2 Супкултура на клеточните линии 30 3.2.1.3 Криопрезервација на клетките 30 3.2.1.4 Број на клетки, кривини на раст, одржливост 30 3.2.2 Ретровирусна инфекција 31 3.2.2.1 Користени плазмиди 31 3.2. 2.1 Трансформација 31 3.2.2.2 Мини-подготовка на ДНК 32 3.2.2.3 Макси-подготовка на ДНК 33 3.2.2.4 Фотометриско одредување на концентрацијата на ДНК-растворот 33 3.2.2.5 Електрофоретичко одвојување на ДНК-фрагменти 34 3.2.2.6 Трансдукција 34 3.2. 2.6.1 Трансфекција со посредство на калциум фосфат 34 3.2.2.6.2 Инфекција на целните клетки 35 3.2.3 Фиксација и парафинско вградување на контролите 35 3.2.4 Методи на боење 37 3.2.4.1 Имунохистохемија 37 3.2.4.2 Флуоресцентно боење на SAHF 39 3.2.4.3 SA-бета-Гал - Боење 39 3.2.4.4 Евалуација на боењето на ткивото 40 3.2.5 Мерења на протокот цитометриски: BrdU-PI профил 40 3.2.6 Избор на пациенти и податоци за следење 41 3.2.7 Анализа на мутација на онкоген К-рас 42 3.2.8 Статистика 42 4
4 Резултати 43 4.1 Производство на контроли на стареење од фибробласти 43 4.2 Стареење во криогени ткива 47 4.3 Стареење во парафински ткива 53 4.4 Евалуација на клиничката важност 65 5 Дискусија 73 5.1 Споредба со тековната литература 74 5.2 Критички забелешки 80 5.3 Изглед 81 6 Резиме 83 7 Додаток 85 7.1 Библиографија 85 7.2 Список на слики 95 7.3 Список на табели 96 7.4 Список на кратенки 97 7.5 Список на публикации 99 8 признанија 100 9 биографија 101 10 потврда 103 5
Започнување на оштетување на ДНК на кое клетката реагира со стареење, премагнагниот тумор запира во нејзиниот раст. Ткивото може да се заштити од прогресија во малигнен тумор. Слика 5: Стареење предизвикана од терапија. Улога на стареење кај премалигни и малигни тумори. Активирањето на онкогенот во нормалните клетки доведува до почетна хиперпролиферација. Како резултат на оштетувањето на ДНК, се активира програмата за супресија на туморот, со што се запира растот на премагнагниот тумор. Пронајдени се типични карактеристики на стареење. Ако се појави мутација што ја исклучува програмата за потиснување на туморот или, како алтернатива, ако има намалување на придружните фактори кои ја промовираат стареењето, туморот почнува повторно да расте и се развива инвазивна малигност. Ако малигниот тумор се третира со хемотерапевтски агенси, ако реагира, тој се доведува до апоптоза на клетките или повторно до стареење на апсењето на крајниот клеточен циклус. Што точно се случува во молекуларна биолошка смисла за време на прогресијата на премалигниот тумор во карцином е нејасно. Од една страна, може да се замисли мутација на ефектот 20
Иницирање на сигналната патека на машинеријата за стареење, на пр. мутација p53, со која премалигнаниот тумор почнува инвазивно да се размножува на неконтролиран начин. Алтернативен модел ја гледа стареењето во премагнагната лезија како израз на онкогената активност заедно со други фактори кои промовираат стареење. Овие фактори може да вклучуваат автономни клетки и евентуално локални неклеточни автономни состојби како на пр. васкуларна густина, присуство на хипоксија и цитокини излачувани од макрофагите. Прогресијата во инвазивен карцином потоа се објаснува со понискиот про-старечки притисок што овозможува надминување на ОИС. Клучна разлика во овој модел е тоа што клетките остануваат генетски способни за стареење. Сè уште може да има неколку мали области на возраст во малигниот тумор што е формиран. Ако некој сега се лекува со хемотерапевтски агенси, туморот може или повторно да застане во стареење или да премине во апоптоза ако има одговор на терапијата. 21-ви
Материјал и методи 3 Материјал и методи 3.1 Материјал Лабораториски хемикалии се снабдени од Мерк (Германија), Биохром (Германија), Сигма (Германија), Рот (Германија), Електрофореза на Серва (Германија), Биолаби од Нова Англија (Германија), ДАКО (Данска) и Гибко (САД) има извори на највисоко ниво на квалитет. Уреди и додатоци, како и материјали за клеточна култура се добиени од Фалкон (Германија), Епендорф (Германија), Нунк (Германија) и Техно пластични производи (Швајцарија) како стерилни предмети за еднократна употреба. Материјалите за повеќекратна употреба беа автоклавирани. Хемикалии и материјали од други производители се прикажани на следната листа. 3.1.1 Клеточни линии и бактериска линија IMR90 колекција на американски тип култури (ATCC), САД (CCl-186) приврзани диплоидни човечки фибробласти на белите дробови од 16-недела стар фетус феникс еко Нолан лабораторија, САД 135 приврзана човечка ембрионална бубрежна клеточна линија 293T E. coli (DH5α) инвитроген Германија 3.1.2 медиум медиум за одгледување клетки (складирајте на 4 C) Дулбеко модифициран орел медиум (ДМЕМ + 4500 мг/л глукоза + Л-глутамин + пируват) + 10-15% FBS + 100 U/ml медиум за замрзнување на пеницилин-стрептомицин ( чувајте на 4 C) FBS (серум од фетално теле) + 10% ДМСО супа од лизогени (LB) медиум 10 g/l триптон + 5 g/l NaCl, (евентуално + ампицилин) 23
Материјал и методи 3.1.3 Раствори PBS (солен раствор со фосфат) (чувајте на собна температура) 8 g NaCl (137 mm) + 0,2 g KCl (2,7 mm) + 1,44 g Na 2 HPO 4 (10 nm ) + 0,24 g KH 2 PO 4 (2 mm) наполнете до 800 ml со dh 2 O; титрира до pH 7,4-1 l наполнете со раствор dh 2 O S1 (мини-препарат) (чувајте на 4 C) 50 mm глукоза + 25 mm Tris-HCl (ph 8,0) + 10 mm EDTA (ph 8, 0) во dh 2 O P1 раствор (мини препарат) (чувајте на 4 C) S1 раствор + 100 μl/ml RNase A додадете свеж раствор S2 во секој случај (мини препарат) (чувајте на собна температура) 0,2 N NaOH + 1% SDS во 2 О свежо подготвувајте секој пат кога раствор S3 (мини-подготовка) (чувајте на 4 C) 60 ml 5 M ацет на калиум + 11,5 ml оцетна киселина + 28,5 ml т.е. 2 O 50 x TAE (чувајте на РТ) 242 g Трисбаза + 57,1 ml глацијална оцетна киселина + 100 ml 0,5 М EDTA (pH 8,0) SA-бета-Гал-PBS (чувајте на RT) PBS + 1 mm MgCl 2 титриран до pH 6 за човечко ткиво СА-бета-Гал-Фиксативен СА-бета-Гал-ПБС + 2% параформалдехид + 0,25% глутаралдехид 24
Материјал и методи раствор на Х-Гал СА-бета-Гал-ПБС + 1 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-ß-Д-галактозид + 50 μл/мл 20 х раствор на калиум цијанид 20 х раствор на калиум цијанид (на 4 C) 820 mg K 3 Fe (CN) 6 + 1.050 g K 4 Fe (CN) 6 x 3h 2 0 наполнете до 25 ml со PBS Mowiol 4-88 (чувајте ги парчињата на -20 C, загревајте на 37 C пред употреба ) Измешајте 8 g Мовиол + 40 ml 0,2 М Tris-HCl (pH 8,5) на 50-60 C; По ладењето: +20 мл глицерол + 2,5% DABCO QIAamp DNS Мини комплет Квиаген, Германија BigDye Terminator v1.1 Кит секвенциониран комплет 3130 генетски анализатор, биосистеми, САД 3.1.4 Плазмиди, плазмидна 'рбетна коска Вметнете потекло pbabe-ras pbabe-puro H-rasV12 Scott Lowe pbabe-празно pbabe-puro - Scott Lowe 3.1.5 Уреди и додатоци Биофотометар 8,5 мм Епендорф, Германија Целметар на проток (сортирање на ќелии со активирана флуоресценција, FACS) FACSCalibur Becton Dickinson, Германија Уред за вградување EG1160 Leica, Германија 25
Материјали и методи Електрофореза Напојување Е835 Конзорт, Белгија Апарат за одводнување ASP300 Leica, Германија Инкубатор Стери-култ 200 Labotect GmbH, Германија Инвизорб Плазмид Максикит Инвитек, Германија Camera Inteq, Германија Kryostat FrigoCut 2800 Reicher-Jung, Германија Microtom RM20ope Leica, Германија Opt Микроскоп за боење со флуоресценција Зејс Аксиоплан г. Замрзнувачка г-дин Фрости (1 С во минута) Налген Лаборатори Комората за броење Нојбауер подобрена Длабочина од 0,1 мм парафински касети Супериор Мариенфелд, Германија Медитеј, Германија Стерилна банка Кендро ХераСафе Хереус, Германија Азотен резервоар Термолот 6 Термомиксер комфор 1,5 ml Eppendorf, Германија Греење на орманот Function Line Heraeus, Германија Центрифуга Eppendorf 5417 R Eppendorf, Германија Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0 R Heraeus, Германија 26
Материјал и методи 3.1.6 Антитело потекло од антиген Компанија расцепена технологија за сигнализација на клетки од зајак, каспаза 3/Asp175, САД (# 9661) H3K9me 3 зајак Абкам, САД (ab8898) глушец HP1 γ Чемикон, САД (MAB3450) глушец Ki67, Дако, Данска (M7240 ) P16 Mouse Novocastra, UK (NCL-p16-432) P53 Mouse Oncogene, Германија (OP43, AB-6) PAI-1 Mouse Novocastra, UK (Ncl-PAI-1) Phospho-Chk2 (Thr68) Rabbit Cell Signal Technology, САД (# 2661) Фосфо-Ерк 1/2 (Thr202/Tyr204) Технологија на сигнализација на клетки од зајак, САД (# 4376) Технологија на сигнализација на зајачки клетки, САД (# 2577) Фосфо-П53 (Ser15) Технологија на сигнализација на зајачки клетки, САД (# 9284) PML глушец ДАКО, Данска (M7202) Флуоресцентни секундарни антитела против глушец IgG коза GIBCO Инвитроген, Германија, (Alexa Fluor 594; A21121) Флуоресцентен анти-BrdU глушец GIBCO Инвитроген, Германија (MD5300 ) Втор антитела против зајак Магаре Дијанова, Германија LSAB-AP Кит Дако, Данска (K0689) LSAB-HRP Кит Дако, Данска (K0690) 27
Материјал и методи 3.2 Методи Слика 6 дава преглед на експерименталното поставување и времето на одделните чекори Слика 6: Преглед на методот. Преглед на одделните чекори на експериментите. Чекор А: Производство на контроли за старечки фенотип од фибробласти IMR90. IMR90 беа ретровирусно заразени со рас или празен вектор. По крајот на изборот, тие беа оставени во културата шест дена. За тоа време, се појави старечкиот фенотип на IMR90ras, додека празнењето IMR90 продолжи да се шири. Извршени се разни тестови на стареење, како што се криви на раст, анализа на СА-бета-Гал и анализа на клеточен циклус. Инфицираните клетки беа замрзнати од шок како клеточни пелети или за криоконтроли или дехидрирани за контрола на парафинот и вградени во парафин. Чекор Б: Криоконтролите IMR90 и колоректалните криогени ткива (5 нормални ткива, 12 аденоми, 6 карциноми) биле испитани за стареење со СА-бета-Гал анализа и имунохистохемиско откривање на Ki67. Чекор Ц: парафин IMR90 28