Од медицинската универзитетска клиника
1 Од Медицинскиот универзитетски клинички оддел за интерна медицина ΙΙΙ на Универзитетот Алберт Лудвиг во Фрајбург i. Ул. Улогата на TRAF2 и TRAF6 во атеросклерозата - добивање диплома за медицински доктор на медицинскиот факултет на Алберт-Лудвигс-Универзитет Фрајбург i. Бр. Презентиран во 2010 година од роден во Питер Стахон Гепинген
2 декан: проф. Д-р. Д-р х.ц. мулт Хуберт Ерих Блум 1-ви рецензент: ПД Др. Андреас Зирлик 2-ри рецензент: ПД Др. Мајкл Хофман Година на д-р: 2011 година
4 Содржина TRAF2 и TRAF6 кај атеросклероза Генотипизација на глувци: изолација на ДНК Генотипизација на глувци: Полимеразна верижна реакција (ПЦР) Трансплантација на клетки на црниот дроб на фетусот кај глувци Процес на трансплантација на клетки на црниот дроб на фетусот Генерација на матични клетки на донатори Генотипирање на донатори: Киаген-комплет Матични клетки и трансплантација Трансплантација на матични клетки на црниот дроб на фетусот кај глувци ЦД45.1 Студија за хранење Ретроорбитална колекција на крв пред диета Диета со високи дози на холестерол Евалуација на атеросклероза Подготовка на глувци по 18-недела диета со високи дози на холестерол Производство на препарати на абдоминална аорта Производство на хистолошки препарати Обојување Масло-црвено-О Боење за дамка на содржина на маснотии во артерискиот wallид Имунохистохемиско MAC-3 боење за макрофаги во артерискиот wallид Имунохистохемиско боење на CD4 + T помошни клетки Имунохистохемиско мазно мускулно боење на К Колаген: Пикрозириус Црвено боење Евалуација Фотографирање на деловите Евалуација на аортниот корен Евалуација на аортните лакови и абдоминалната аорта. 42
8 Вовед TRAF2 и TRAF6 во атеросклероза Сл. 1: Во Европа, кардиоваскуларните болести се најчеста причина за смрт И мажите (горе) и жените (подолу) болести на кардиоваскуларниот систем се најчеста причина за смрт. Поголемиот дел од овие болести се патофизиолошки засновани на атеросклероза. Извор:
52 Резултати од TRAF2 и TRAF6 кај атеросклероза По четиринеделна фаза на реконституција, беше земена крв од глувците и се процени со помош на FACS за реконституција на ЦД45.1 со двојно боење со ЦД45.1-АПЦ и ЦД45.2-ПЕ. Овој експеримент покажува успешна реконституција: 95,2% и 95,0% од крвните клетки биле заменети со матичните клетки добиени од црниот дроб на фетусот. Понатаму, се покажа дека ЦД19-позитивни Б-лимфоцити, ЦД3-позитивни Т-лимфоцити и CD11b-позитивни леукоцити како што се моноцити, макрофаги, гранулоцити и природни клетки убијци го носат површинскиот маркер CD45.1 по трансплантацијата на клетките на црниот дроб на фетусот. Ако некој поблиску ги анализира овие подгрупи, ќе се види дека CD11b- и CD19-позитивните клетки беа заменети со донаторските клетки на повеќе од 99%. Само во групата Т-клетки има околу 4% од клетките-приматели, кои се најверојатно клетки на Т-меморијата (Слика 7).
53 Резултати TRAF2 и TRAF6 во атеросклероза Сл. 7: Успешна реконституција на периферни крвни клетки со трансплантација на фетални клетки на црниот дроб глувци LDLR -/- глувци (CD45,2 позитивен/cd45,1 негативен, A) беа озрачени миелоаблативно (2x450cGy) и со фетални клетки на црниот дроб од денови стари фетуси (ЦД45,2 негативни, ЦД45,1 позитивни, Б) реконституирани. 4 недели подоцна, глувците беа искрварени и беше извршена анализа на FACS на пресадените животни за површинските обележувачи ЦД45.1 и ЦД45.2 (на пример, Ц.)
59 резултати TRAF2 +/+/LDLR -/-: mm2, 0,53 ± 0,18 +/+ контролна група (TRAF2/LDLR исто така TRAF2- матични клетки хетерозиготи реконституирани TRAF2 и TRAF6 во атеросклероза -/- N = 13, p = +/+ 0,56) во споредба со -/- до 2 во TRAF2/LDLR: 0,41 ± 0,08 mm, N = 16). Приматели кои имале слична големина на атеросклеротични лезии со недостаток на TRAF2 (TRAF2 -/-/LDLR -/- во TRAF2 +/-/LDLR -/-: 0,48 ± 0,01 mm2, N = 17, p = 0,60, слика 12). Покрај големината на атеросклеротичната лезија, неговиот состав е исто така од голем интерес, бидејќи влијае на стабилноста на плаката. Ако се зголеми процентот на липиди во плаката, ова е поврзано со зголемена инциденца на прекин на плаки кај луѓето. Недостаток на TRAF2, сепак, нема влијание врз содржината на липиди во атеросклеротичните лезии (Слика 12). Б 0,08 p = 0, p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/во TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/во TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/во TRAF2 +/-/LDLR -/- Масло-црвено-О позитивно боење/големина на лезија на целиот vesselид на садот (mm 2) A 0,15 p = 0,54 p = 0, TRAF2 +/+/LDLR-/во TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/во TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/во TRAF2 +/-/LDLR -/- C TRAF2 +/+/LDLR-/во TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/во TRAF2 +/+/LDLR -/- TRAF2 -/-/LDLR-/во TRAF2 +/-/LDLR -/- Сл. 12: Недостаток на TRAF2 нема никакво влијание врз Големината сè уште влијае на содржината на липиди во атеросклеротичните лезии
66 Резултати TRAF2 и TRAF6 кај атеросклероза TRAF6 не го менува составот на атеросклеротични лезии.Следно, беше тестирана хипотезата дали TRAF6 има влијание врз составот на атеросклеротични лезии. Кај луѓето, ова има последици за стабилноста, а со тоа и за подложноста на руптура на атеросклеротична лезија. Затоа, според диетата, беа подготвени хистолошки делови што беа обоени во макрофагите (слика 17А), липидите (слика 17Б), клетките на мазните мускули (слика 17С), колагенот (слика 17Д) и Т-клетките (слика 17Е) беа. Излезе дека дефицитот на TRAF6 нема никакво влијание врз составот на атеросклеротичната лезија, бидејќи не е пронајдена значајна разлика помеѓу трите групи во сите изведени боење.
67 Резултати TRAF2 и TRAF6 кај атеросклероза А-3 позитивна област (%) p = 0,23 p = 0,52 B Масло-црвено-О позитивна област (%) p = 0,58 p = 0,98 C α- актин позитивна област (%) p = 0,95 p = 0,16 D picrosirius репозитивна област (%) p = 0,36 p = 0,66 E 100 CD4 + клетки/wallид на крвниот сад p = 0,74 p = 0,21 TRAF6 +/+/LDLR -/- во TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- во TRAF6 +/+/LDLR -/- TRAF6 -/-/LDLR -/- во TRAF6 +/-/LDLR -/- 0 Сл. 17: Недостаток на TRAF6 ја менува плаката Состав кој не е миеолаблативно озрачен TRAF6 +/+/LDLR -/- глувците добиле или TRAF6 +/+/LDLR -/- (бели прачки, N = 21) или TRAF6 -/-/LDLR -/- матични клетки (изведени шипки, N = 21) Глувците TRAF6 +/-/LDLR -/- беа реконституирани со матични клетки TRAF6 -/-/LDLR -/- (црни шипки, N = 22). После тоа, сите групи добија диета богата со холестерол 18 недели, на крајот од која составот на атеросклеротичните лезии во областа на корените на аортата беше квантифициран со помош на имунохистохемиско боење. Резултатите за макрофагите (А), липидите (Б), мазните мускулни клетки (Ц), колагенот (Д) и Т-клетките (Е) се собираат и се прикажани како средно ± СЕМ.
68 Резултати TRAF2 и TRAF6 во атеросклероза TRAF6 нема никакво влијание врз атерогенезата во опаѓачката аорта и во аортниот лак Бидејќи атеросклерозата може да се развие поинаку во различни точки на васкуларниот систем, се спушта аортата до бифуркацијата по лице на липиди испитани со помош на Oil-Red-O. Како што се очекуваше, немаше разлики во абдоминалната аорта помеѓу животните со недостаток на TRAF6 (21,0 ± 2,9%, N = 8, p = 0,90) или TRAF6-компетентен (20,5 2, 6%, N = 8) биле пресадени матични клетки. TRAF6 +/-/LDLR -/- примателите кои примале матични клетки со хематопоетски дефицит на TRAF6 (25,2 ± 2,6%, N = 10, p = 0,23) исто така имале слична дистрибуција на липиди како контролната група (Сл. 18А и Б). Дури и во хистолошки анализираните лакови на аортата, животните трансплантирани со матични клетки со недостаток на TRAF6 имаат големини на плаки слични на оние во контролната група (TRAF6 -/-/LDLR -/- во TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,012 ± 0,003 mm 2, N = 18, p = 0,85, TRAF6 -/-/LDLR -/- во TRAF6 +/-/LDLR -/- (0,020 ± 0,006 mm 2, N = 16, p = 0,85, TRAF6 +/+/LDLR -/- во TRAF6 +/+/LDLR -/-: 0,013 ± 0,003 mm 2, N = 20, слика 18 C и D).
69 Резултати TRAF2 и TRAF6 кај атеросклероза Слика 18: Недостаток на TRAF6 ја менува дистрибуцијата на липидите во абдоминалната аорта и големината на атеросклеротичните лезии во аортниот лак, а не миелоаблативно озрачени TRAF6 +/+/LDLR -/- глувците добиле или TRAF6 +/+/LDLR -/- (бели прачки, N = 8) или TRAF6 -/-/LDLR -/- матични клетки (изведени шипки, N = 8). Глувците TRAF6 +/-/LDLR -/- беа реконституирани со матични клетки TRAF6 -/-/LDLR -/- (црни шипки, N = 10). После тоа, сите групи добија диета со висок холестерол 18 недели, на крајот на која беше анализирана атеросклерозата во абдоминалната аорта по боење со Oil-Red-o против липиди на лицето. Здружените резултати се дадени како Oil-Red-O по вкупна површина ± SEM (A), во долниот ред репрезентативните аорти се фотографираат без зголемување (B). После диетата, направени се хистолошки делови од аортни лакови и обоени со Oil-Red-O. Здружените големини на атеросклеротичните лезии ± СЕМ се прикажани во горниот ред (С), подолу се претставени репрезентативни хистолошки делови со масло-црвено-О во 4x зголемување (Д).