Односи помеѓу кластери на оксидативно оштетени нуклеотиди и активни или отворени нуклеозоми

предмети

апстрактен

Распределбата на оксидативното оштетување на базите како што е 8-хидроксигуанин (8-OH-Gua) е утврдена на ниво на резолуција на нуклеотид со употреба на PCR-техниката со посредство на лигатура. Познато е дека администрацијата на бубрежен канцероген, железо (III) нитрилотриацетат (Fe-NTA), предизвикува оксидативен стрес и последователно формирање на 8-OH-Gua во бубрезите. Вкупната геномска ДНК беше изолирана од бубрег кај стаорци со или без третман на Fe-NTA и потоа се вари со формамидопиримидин ДНК гликозилаза (Fpg). Како цел, ние се фокусиравме на генот на ензимот за обновување на ДНК за тимин гликол, Nth 1. Разделени сигнали се пронајдени во егзон 1 и егзон 3, но не и во егзон 5. Нуклеозомите збогатени со оштетени нуклеотиди во овие региони беа многу достапни за микрококна нуклеаза, особено во бубрезите. Земајќи ја предвид функцијата на протеинскиот сегмент кодиран од овие региони, разговаравме за молекуларниот механизам на ограниченото формирање на оштетените нуклеотиди.

вовед

Реактивните видови кислород (РОС) предизвикуваат разни видови на оштетување на ДНК, како што се раскинувања на единечни влакна, паузи на двојни жици, модификации на основи, вклучувајќи места на апурин и апиримид и вкрстено поврзување на ДНК-протеини (Диздароглу, 1991, 1992; Халивел и Аруома, 1991)). Оксидативно оштетување на клеточните геноми е предложено да игра улога во рак и стареење (Акман и сор., 1991; Басу и сор., 1989; Феиг и сор., 1994; Лоеб и сор., 1988; Макаби и сор., 1994; МекБрајд и сор., 1991; Морија и сор., 1991; Ткешелашвили и сор., 1991; Вајцман и Гордон, 1990; Вуд и сор., 1990). 8-хидроксигуанин (8-ОХ-Гуа) е главна форма на оштетување на оксидативната ДНК (Касаи и Нишимура, 1993; Умемура и др., 1990) што главно предизвикува трансверзии на GC → TA во клетките на Ешерихија коли и цицачи (Ченг и др. 1992 година) Варијациите во количината на 8-OH-Gua во клеточната ДНК може да се измерат со HPLC-ECD (Флојд и сор., 1986; Касаи, 1997). Сепак, односот помеѓу предизвиканата штета на ДНК и спектарот на мутација не е разјаснет бидејќи сè уште не е утврден соодветен метод за откривање на оштетени нуклеотиди во ДНК in vivo.

Неодамна, PCR (LM-PCR) со посредство на лигатура, направи чекор напред во откривањето на оштетените нуклеотиди на ниво на резолуција на нуклеотиди (Денисенко и сор., 1996). LM-PCR првично беше развиен за геномско секвенционирање вклучително и откривање на местата за метилација на CpG и исто така и за in vivo отпечатоци (Кониши и сор., 1995; Мулер и Волд, 1989, 1991; Номото и сор., 1995; Фајфер и др. 1989). Оттогаш се применува на анализата на местата на расцепување на нуклеазата, на пример, микрококна нуклеаза или варење на ДНаза I, за истражување на хроматин (Като и сор., 2000).

Протеинскиот сегмент кодиран со егзоните 1 и 2 е единствен за Nth 1 кај цицачите и содржи нуклеарни и митохондоријални сигнали за таргетирање и наводни места за интеракција за други компоненти за поправка. Протеинскиот сегмент одговорен за бифункционалните ензимски активности, активноста на ДНК гликозилазата и активноста на АП лиазата е кодиран со егзоните од 3 до 6. Со цел да се утврди молекуларниот механизам на ограничено формирање на оштетени нуклеотиди во егзоните 1 до 4, ја анализиравме структурата на хроматинот на црниот дроб, бубрезите и слезината кај контролните стаорци. Нуклеозомите во егзоните 1-4 од генот Nth 1 беа лесно достапни за MNase, особено во бубрезите. Ова набудување може да обезбеди индикација за подложност на бубрежна карциногенеза.

Резултати

Регионално ограничено формирање на оштетени нуклеотиди во генот Nth 1

помеѓу

Дистрибуција на оштетените нуклеотиди во генот Nth 1. ( а ) Распределбата на местата раздвоени со пиперидин или дигестирани во Fpg на геномската ДНК од бубрезите во одреденото време по третманот со Fe-NTA или контролниот бубрег без третман беше анализирана со LM-PCR. Геномската ДНК од бубрезите на контролните животни исто така реагираше со ДМС, потоа се вари со пиперидин и се користи како скалило со гванин (Г). Прикажани се профилите на расцеп на нетранскрибираната нишка во егзонот 1 од Nth 1 генот. „Txn“ ја означува позицијата на почетната страница за почеток на транскрипција. ( б ) Распределба на местата што се варат со Fpg на геномската ДНК, како што е опишано погоре. Прикажани се профилите на расцеп на нетранскрибираната нишка во егзонот 3 од генот Nth 1. ( в ) Прикажана е дистрибуција на местата што се варат со Fpg на нетранскрибираната низа во егзонот 5 од генот Nth 1

оксидативно

Резиме на оштетените нуклеотиди во генот Nth 1. Се споредуваат секвенците на глувчето (М) и стаорецот (R). Изведените аминокиселини може да се видат погоре (глушец) и подолу (стаорец). Нуклеотидните дивергенции помеѓу генските низи Nth-1 на глувци и стаорци се означени со превртени (исполнети квадратни) црни букви. Инферираната замена на аминокиселините е означена и со превртени (исполнети квадратни) црни букви. Оштетените нуклеотиди во генот Nth-1 на стаорец се прикажани со црвена боја; Превртените (исполнети квадратни) црвени букви означуваат оштетени нуклеотиди кои биле откриени на непрепишаната низа, додека квадратните црвени букви ги означуваат оние што биле откриени на препишаната низа. Подвлеченото во егзонот 1 означува прелиминарен сито сигнал на митохондрија, додека оној во егзон 2 означува наводен сигнал за нуклеарна локализација. Плоштадот Lys во егзон 4 означува активен центар на активност на ДНК гликозилаза, додека пак квадратот Asp во егзон 5 покажува активен центар на активност на АП лиаза

Организација на структурите на хроматинот во генот Nth 1

кластери

Боење со етидиум бромид, фрагменти варени од микрококна нуклеаза (MNase). Хроматините произведени од црн дроб, бубрег и слезина се вареле со MNase како што е наведено (U/ml), а по екстракција на ДНК, како што е опишано во Материјали и методи, варените ДНК фрагменти се електрофоретирани на 1,5% агарозен гел

односи

Анализа на местата на расцепување на микрококна нуклеаза (MNase) во генот Nth 1. ДНК-фрагменти варени од микрококна нуклеаза, подготвени од црн дроб, бубрег и слезина, како што е опишано на слика 3, беа анализирани со LM-PCR. Лентата означена како „G-скала“ претставува скалило на гванин, како што е опишано на слика 1. Проценетата позиција на нуклеозомската фаза е прикажана на десната страна од панелот. ( а ) Распределба на раздвоени места на микрококна нуклеаза во егзон 1 на Nth 1 ген. „Txn“ ја означува позицијата на почетната страница за почеток на транскрипција. ( б ) Распределба на оние во егзон 3 од генот Nth 1. ( в ) Распределба на оние во егзон 5 на генот Nth 1

дискусија

Протеинскиот сегмент кодиран со егзоните 1 и 2 е единствен за Nth 1 кај цицачите и се верува дека содржи нуклеарни и митохондријални целни сигнали и места за интеракција за другите компоненти на системот за поправка (Икеда и сор., 1998). Неодамна, Клунгланд и др. (1999) покажа дека XPG протеинот ги активира човечките и S. pombe Nth 1 и го стимулира врзувањето на Nth 1 протеинот со ДНК што содржи лезии преку индиректна интеракција помеѓу Nth 1 и XPG. Не е забележано активирање или стимулација од страна на XPG за E. coli Nth 1. Затоа, мутациите во овие региони може да резултираат во абнормална интрацелуларна локализација на мутираниот Nth 1 протеин или нарушување.

материјали и методи

Ивотни

Стари шест машки стаорци Вистар се купени од Експериментално животно Сеива (Фукуока, Јапонија). Им беше дадена комерцијална храна за стаорец (Клиа, Токио, Јапонија) и рекламна вода од чешма и се користеа по 4 дена аклиматизација.

Хемикалии и Fpg

Fe (NO 3) 3, Na 2 NTA и ДН Екстрактор ВБ комплет се купени од Wako Biochemicals (Осака, Јапонија). Пиперидин и диметил сулфат (ДМС) се од Накалаи Теск (Кјото, Јапонија). Растворот на ферим нитрилоацетат (Fe-NTA) беше непосредно пред употреба според методите на Awai et al. (1979) со мала измена. Накратко, Fe (NO 3) 3 и Na2NTA се растворени во Milli-Q вода и потоа се мешаа во моларен сооднос од 1: 4. PH вредноста беше прилагодена на 7,4 со NaHCO 3. Fpg е добиена од Тревиген (Каталог бр. 4040-100-01). Геномската ДНК се вари со Fpg според упатствата на производителот.

Третман со Fe-NTA

Вкупно 30 животни беа поделени во Fe-NTA и контролни групи. Во групата Fe-NTA, тие биле убиени 1, 6, 24, 72 и 120 часа по инјектирањето на Fe-NTA (15 mg Fe/kg телесна тежина IP). Во контролната група, тие биле убиени без лекување. Секоја подгрупа содржеше по пет животни. Theивотните беа жртвувани под етерска анестезија. Бубрезите биле отстранети веднаш и потоа користени за експериментите. Дел од органот беше замрзнат и се чуваше на -80 ° C.

ПЦР посредувано со лигација (LM-PCR)

ДНК беше извлечена од бубрезите на стаорци (100-200 мг) со помош на комплетот ДБ-екстрактор СБ според методот на Накае и сор. (1995). Извлечената ДНК се вари со Fpg како што е опишано погоре или се вари со 1 М пиперидин 30 минути на 90 ° C (Максам и Гилберт, 1977). Ензимот Fpg ги препознава формамидните пиримидини добиени од аденин, гванин или 8-OH-Gua, како и некои оксидирани производи од пиримидин, како што се 5-хидроксицитозин и 5-хидроксиурацил (Tchou et al., 1994). Од друга страна, хемискиот реагенс пиперидин може да раздвои многу видови на деривати на нуклеотиди, вклучувајќи 8-ОХ-Гуа и сродни соединенија (Чунг и сор., 1992), како и разни видови на деривати подготвени од хемиските реакции од Максам и Гилберт. Како контролна скала на гванин, еден дел од геномската ДНК од контролните животни реагираше со ДМС и се расцепи со пиперидин, како што е опишано погоре. LM-PCR беше извршена како што е претходно опишано (Кониши и сор., 1995; Номото и сор., 1995). Нуклеотидните позиции на расипните сигнали добиени од LM-PCR производи се утврдени од контролната гванинска скала и информациите за редоследот на генот Nth-1 на стаорец.

Информациите за низата за cDNA Nth-1 стаорец опфаќаат само фрагмент од 3'-329 бп (GenBank H33255). Секвенцата Nth-1 ген за стаорец потребна за дизајнирање на буквари за LM-PCR е добиена од геномички PCR производи за стаорци засилени со прајмери ​​засновани на истегнувања на нуклеотиди помеѓу ND-1 cDNA беа зачувани кај глувци и луѓе (Аспинвал и др., 1997; Хилберт и сор. 1997). Нуклеотидните низи на индивидуалните LM-PCR буквари беа како што следува. За егзон 1 на Nth 1 ген: прајмер 1, 5'-gcctggagctaaagttccacg-3 '; Буквар 2, 5'-cccctgcaggcgcagcg-3 '; Буквар 3, 5'-ccctgcaggcgcagcgctacCTGC (големи букви ја означуваат низата на егзонот). За егзон 3: прајмер 1, 5'-gtagtcagagatgcctgcctc-3 '; Буквар 2, 5'-ctccagaacagtgccccctcttgg-3 '; Буквар 3, 5'-ccagaacagtgcccctcttggttctgttgcc-3 '. За егзон 5: прајмер 1, 5'-Cagcaggatacctctctccc-3 '; Буквар 2, 5'-КакаактактактакТЦГГГТАГЦ-3 '; Primer 3, 5'-ccaagctacactacCTGGGTAGCCACTCTTCCAGG-3 '. Букварите 1 и 2 се користеа за првата синтеза на влакната и засилувањето на PCR, соодветно. Букварите 3 беа обележани на крајот од 5 'со γ- 32 P-ATP и се користеа за конечно откривање на скалилата.

Варење со микрококна нуклеаза

Фракции на хроматин од црн дроб, бубрег и слезина од контролни стаорци беа подготвени како што е опишано (Горски и сор., 1986; Голдхамер и сор., 1995). Хроматинска суспензија во тампон за варење, 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,5 mM DTT, 0,15 mM спермидин, 0,34 mM сахароза, 0,1 mM PMSF и 1 mM M CaCl 2 се вари со сериски разредувања на микрококна нуклеаза (Worthington Biochemical Corp.) на 20 ° C за 5 минути. По екстракцијата на ДНК опишана погоре, 5-краевите на местата расцепени со MNase беа фосфорилирани со Т4 полинуклеотид киназа и ладен АТП (Мекферсон и сор., 1993; Трус и сор., 1995). Електрофорезата на извлечената ДНК беше спроведена на 1,5% гел од агароза. Примероците на ДНК биле подложени на LM-PCR како што е опишано погоре.

благодарноста

Оваа работа беше поддржана од грантови за истражување на рак од јапонското Министерство за образование, култура, спорт, наука и технологија и здружението за рак Фукуока, Фукуока, Јапонија.