Препознавање на ензим-супстрат во катализирани реакции на преклопување на протеини - PDF бесплатно преземање

Препознавање на ензим-супстрат во катализирани реакции на преклопување на протеини

препознавање

Препознавање на ензим-супстрат во катализирани реакции на преклопување протеини Дисертација за стекнување со академски степен лекар rerum naturalium (д-р ре. Нат.) Презентирана на ПМФ на биолошки науки на Универзитетот Мартин Лутер Хале-Витенберг од дипломираната хемичарка Каролин Хаупт родена на 28 јуни 1980 година во Карлсбург Хале (Зале) 2009 година

Апликација за докторат поднесена на: 8 октомври 2009 година Ден на научен колоквиум: 21 декември 2009 година Рецензент: (1) Проф. Милтон Т. Стубс (2) Проф. Др. Јохен Балбах (3) ПД Др. Јохен Рајнштајн

Вистинскиот научник ја слуша интелигенцијата на природата и ја гледа природата на нештата. Ентони Г. Еј Блејк

Содржина 3.2.3. Резиме дискусија: локализација на местата за врзување во SlyD * и карактеризација на активноста на шампионот. 103 3.3. Функција на пептидил пролил изомераза на SlyD *. 105 3.3.1. Важноста на мутацијата Y68W за каталитичкиот механизам на пролил изомеразата SlyD *. 105 3.3.2. Студија за NMR во реално време за катализирање на преклопувањето на RNase T1 (S54G/P55N). 107 3.3.2.1. 3Д NMR спектроскопија за доделување на кинетичко средство за преклопување на RNase T1 (S54G/P55N). 108 3.3.2.2. NMR спектроскопско откривање на втора конформација кај природната RNase T1 (S54G/P55N). 111 3.3.2.3. Набervationудување на катализата на преклопување со сериски снимени 2D 1 H/15 N-TROSY-HSQC спектри. 113 3.3.3. Резиме дискусија: Набvationудување на NMR во реално време на SlyD * катализирано преклопување на минливиот преклопен интермедијар на RNase T1 (S54G/P55N). 119 4. Резиме. 121 5. Резиме. 123 6. Список на кратенки. 125 7. Библиографија. 129 8. Додаток. 143 8.1. Илустрации. 143 8.2. Табели 159 8.3. Програми за пулс. 175 8.4. Феликс макроа. 191 9. Сопствени публикации. 193 10. CV. 194 11. Признанија. 195 III

Температурата на воведувањето и каталитичките услови се оптимизирани. Покрај тоа, развојот и адаптацијата на методите на NMR во реално време што треба да се користат се неопходни за ова прашање. Целта на сегашната работа треба да биде молекуларно разбирање на катализата на бавните реакции на преклопување од страна на PPIases, како и на доменската комуникација помеѓу домените на chaperone и PPIase на SlyD *. 19-ти

Димензијата на материјали и методи евидентирана. Времетраењето на спектарот на FHSQC беше 4 мин. 52 секунди, а спектрите беа проценувани аналогно на титрациите на NMR и анализата на хемиската смена со употреба на равенка [2.14]. 59

Резултатите и дискусијата се обележани. Волуменот на вкрстените сигнали се користи за проценка на развојната транзиција. Намалување на волуменот е забележано за вкрстените врвови на автохтоните видови и зголемување на волуменот за сигналите на денатурираните видови со различно хемиско поместување. Вкупно 93 остатоци од аминокиселини може да се проценат за родната држава (Додаток, Таб. 8-1). Сл. 3-6 1 H/15 N TROSY спектри на SlyD * за време на расплетот предизвикан од уреа. Спектар на SlyD * во родната состојба на 0 M уреа, B во одвиткана состојба на 5,5 M уреа и C на преодната средина на 2,2 M уреа. Транзицијата беше измерена во 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, 10% D 2 O, pH 7,5 на 15 C и концентрација на протеин од 0,67 mm. Соодветната крива на транзиција за доделените вкрстени сигнали е прикажана на слика 3-7. Неколку примери на вкрстени врвови кои покажуваат крива на транзиција според моделот на две состојби се прикажани на Слика 3-7. Остатоци чии вкрстени врвови беа 68

Резултати и дискусија А Б Сл. 3-14 Размена на H/D на SlyD *. А Заштитни фактори на 'рбетниот столб, амидни протони на SlyD * во логаритамски заговор. Правоаголниците претставуваат секундарни структурни елементи, исполнетите правоаголници се залагаат за β-листови, отворени за α-хелики. Б Области со високи (S> 10 4, сини) и ниски заштитни фактори (10 2 S 10 4, цијани) поставени на структурата на SlyD *. Заштитните фактори се пресметани според равенката [2.26]. Областите во кои соодветните вкрстени сигнали се разменија во мртвото време на експериментот (40 минути) се прикажани со сива боја. Неназначените остатоци и пролини се обоени во црна боја. Размена на амидни протони за одредување на брзи реакции на размена Со модифицираната техника MEXICO (Нов MEXICO, 2.7.6.), Процесите на размена може да се одредат во временски прозорец од 10 ms до 250 ms. За 47 амидни протони чија размена со протони на растворувачи не можеше да се открие со размена на H/D поради пониската заштита, беа анализирани повисоки курсеви со New MEXICO во споменатиот временски прозорец. Сл. 3-15Д покажува обнова на магнетизацијата на амидните протони со размена на поларизирани водни протони.

Резултати и дискусија Сл. 3-15 Брза размена на амидни протони (Нов МЕКСИКО). A-C 1 H/15 N-FHSQC спектри пред размена на амидни протони (референца) и 60 ms или 250 ms по почетокот на реакцијата на размена. D Размена на кинетика за избрани остатоци од аминокиселини на SlyD * на pH 7,5 и 15 C. Адаптацијата на кинетиката на моно-експоненцијална функција резултираше со размена на курсеви од 512 ± 5 s -1 (R95), 37 ± 3 s -1 (G86), 14 ± 2 s -1 (S40) и 12 ± 2 s -1 (Q102). Наведените грешки произлегуваат од прилагодувањето кон моно-експоненцијалната функција. Евалуација на реакциите на размена во однос на термодинамичката стабилност може да се изврши само доколку процесот на размена се одвива според механизмот EX2 (2.7.6). Поради зависноста од ph припаѓањето на механизмот EX1 или EX2, новиот експеримент MEXICO се повтори со две други ph вредности (ph 6.0, ph 9.0). Може да се забележи премин во опсегот EX1 за 20 остатоци со висока pH вредност. Овие се изоставени заради термодинамичко разгледување. Заштитните фактори и термодинамичката стабилност се пресметани за преостанатите 27 остатоци од аминокиселини според равенката [2.26] (Додаток, таб. 8-8). 79

7,0 kj/(mol). Присуство на IF домен значи за SlyD * во споредба со изолираниот FKBP домен (SlyD * - IF, G U (H 2 O)

4,7 kj/(mol)) огромна добивка во стабилноста и значително зголемена соработка. Ова исто така го објаснува заедничкиот развој на двата домени. SlyD * се одвива како кооперативна единица за преклопување во која ниту еден од двата домени не може да се расплетува локално кога другиот е преклопен. Со помош на теоријата за размена на водород во природната држава, исто така, може да се покаже дека FKBP се расплетува како единица со доменот IF, бидејќи не може да се детектираат делумно преклопени средни состојби или преклопни подединици. Во присуство на Ni 2+, постои значителна термодинамичка стабилизација на SlyD (1-155). Споредувајќи ја со кристалната структура на TtSlyD (Löw et al., 2009), може да се локализира местото на врзување на металниот јон. Сместено е во последниот α-хеликс (α3) од доменот FKBP во мотив за хистидин: His149-Gly150-His151-Val152-His153 во E.c.SlyD или His145-Gly146-His147-Ala148-His149 во TtSlyD. Овој последен α-хеликс е единствен меѓу протеините кои се врзуваат за FK506 и се јавува само во FKBP кои се хомологни на SlyD. Така, тој не само што претставува нов структурен, туку и нов функционален елемент

Список на кратенки 6. Список на кратенки 1D, 2D, 3D, едно-, две-, тродимензионално A 280 nm AcCN Amp A.U. a.u. bp НАЈДОБРИ BSA или c CD CsA C p δ MW G u (H 2 O) H u (T m) S u (H 2 O) n d [D] [D] 1/2 ddh2o ДНК DTT dyt ε E A E.c. (E. coli) EDTA ESI FID FKBP апсорпција на 280 nm единици за апсорпција на ацетонитрил ампицилин произволни единици базен пар (ДНК) селективно раздвижување по кратко-минливо говоров серумски албумин (говеда серумски албумин) или концентрација на кружен дихроизам Циклоспорин Промена на топлинскиот капацитет (изобарски процес) значи промена во енталпија без стабилизирање на хемиски смени во отсуство на денатуриран ван т Хоф-енталпија промена во ентропија за време на расплетот разликата во индекси на рефракција дебелина на слојот на киветата (во dm) точка на центарот за транзиција на концентрација на денатурација во двојно дејонизирана индукција на денурант (преостаната спроводливост 0,055 μ Ситиотиптреитолинска киселина ) енергетска активација на коефициент на моларно изумирање Ешерихија коли етилендиамин тетраацетат електроспреј јонизација бесплатно индукција распаѓање FK505 врзувачки протеин 125

Список на скратеници МЕКСИКО мин мин. Фуриева трансформација гванидиниум хлорид хлороводородна киселина хетеронуклеарна повеќекратна квантна кохеренција хетеронуклеарна ефект на НОЕ хетеронуклеарна единечна квантна кохеренција Херц (s -1) (Мегахерц, Гигахерц) нечувствително зајакнување на јадра со поларизација трансформација на изопаропила Стапка на некатализирана реакција на преклопување Стапка на обрт Каталитичка ефикасност на ензим Стапка на замена Хемиски курс на затворање Стапка на дисоцијација Константа на рамнотежа Внатрешен курс (определен за модел пептиди) Стапка на катализирана реакција на преклопување Хидрофобен пептид од сигналот на пептидот HiPIP со сигнал на природен натриум концентрација на лизин Магнетски Р. езонанса Зголемување на нуклеарниот надвисен уред Спектроскопија за подобрување на нуклеарниот надвисник Моларна (mol/l) Параметар на соработка мерење на брзиот курс на размена на протони во изотопски обележани соединенија Минута најмалку 126

Список на кратенки MS Ni-IMAC OD P PCR PPIase ppm RCM-T1 RCM-α-La RNase T1 RR s SDS-PAGE SlyD SlyD * SOFAST SUMO T m Tat Tat27 TEMED TFA TFE TOCSY TPPI (Bis-) Tris TROSY U u.u. UV VRR (v/v) WATERGATE WHP масовна спектрометрија Афинитетна хроматографија на јони-метали метална оптичка густина на фактор на полимераза верижна реакција пептидил-пролил-цис/транс-изомераза делови на милион намалени и карбоксиметилирани RNase T1 намалени и карбоксиметилирани а-лакталбумин рибонуклеапси хитрофит-хитрофиаптити Секвенца на сигнал пептид втора Натриум додецил сулфат полиакриламид гел чувствителност на електрофореза на лиза Д EcSlyD (1-165) опсег оптимизиран оптимизиран агол на флип агол, кратко-минлива мала температура на модификатор сличен на убиквитин, на секундацијата на пептидната секвенца на двоен-аргинин транслокон, од CueO N, N, N, N -Тетраметилдиамин трифлуороацетна киселина трифлуороетанол вкупна корелација спектроскопија време пропорционално зголемување на фазата Tris- (хидроксиметил) аминометан оптимизирана релаксација оптимизирана спектроскопија расплетена состојба меѓу другото и вртежи во минута под одредени околности супресија со постепено возбудено возбудување, прекрасен протеин богат со хистидин 127

Список на кратенки (w/v) YpSlyD на пр. Тежина по волумен SlyD од Yersinia pestis, на пример, аминокиселините беа скратени со вообичаените кодови со една или три букви. 128

Додаток 8. Додаток 8.1. Сл. 8-1 Спектар на емисии на флуоресценција од 5 μm SlyD * во 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, pH 7,5 на 15 C. Возбудата се случи на 278 nm. Цврстата линија ја претставува природната состојба, кривата за одвиткана Протеинот е прикажан во испрекината линија. Сл. 8-2 Развиена транзиција на SlyD * -F84W предизвикана од уреа. Откривање на транзицијата на 308 nm по возбуда на 280 nm (триаголници), откривање на 344 nm по возбудување на 295 nm (кругови). Цврстите линии претставуваат прилагодување на податоците кон дво-состојба модел. Резултирачките параметри на стабилност се (по возбуда на 280 nm): GU (H 2 O) = 16,8 ± 0,7 kj/mol, m eq = 6,8 ± 0,3 kj/(mol), [D] 1/2 = 2,5 М. Втората транзиција, која е прикажана зголемена во Б, не може да се процени. Солидната линија е само за полесно прегледување. Транзицијата е измерена во 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, pH 7,5 на 15 C. Концентрацијата на протеини беше 5 µm. 143

Додаток Сл. 8-3 Развој на транзиција предизвикана од уреа од SlyD * - АКО. Расклопна транзиција од SlyD * (отворени симболи) и SlyD * - IF (затворени симболи). Цврстите линии претставуваат прилагодување на податоците кон дво-состојба модел. Резултирачките параметри на стабилност се за SlyD *: GU (H 2 O) = 18,4 ± 0,6 kj/mol, m eq = 6,9 ± 0,2 kj/(mol), [D] 1/2 = 2,7 M и за SlyD * - АКО: GU (H 2 O) = 13,9 ± 0,5 kj/mol, m eq = 3,2 ± 0, 1 kj/(mol), [D] 1/2 = 4,3 M Транзициите се измерени во 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, pH 7,5 на 15 C. Концентрацијата на протеини беше 5 µm. Сл. 8-4 Податоци за калориметрија на изотермална титрација на две хомологни СлиД со Ni 2+. Интегрираната количина на топлина беше исцртана во однос на односот на концентрацијата лиганд/протеин. Во секој случај може да се видат два обврзувачки настани, но адаптацијата на податоците кон соодветниот модел на врзување не беше можна поради меѓусебно поврзаните процеси. Изотермална титрација од 18 µm TtSlyD-His 6 со 270 µm NiCl2 (во 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). Изотермална титрација од 16 μm E.c.SlyD (1-165) -Неговиот 6 со 240 μm NiCl 2. 144

Додаток Сл. 8-5 Изотермални кривини на калориметрија на титрација на TtSlyD со Co 2+, Gd 3+ и Zn 2+. Горната слика ја покажува електричната моќност што е откриена по секое вбризгување на соодветниот метален јон. На сликата подолу, интегрираните количини на топлина се цртаат спротивно на односот на концентрација на метал јон/TtSlyD. Термодинамичките параметри се добиени од нелинеарно прилагодување на експерименталните податоци за врзувачки модел со место за врзување. Изотермална титрација од 27 μm TtSlyD со 270 μm CoCl 2 (во 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). Енталпијата на реакција ослободена со врзување беше -13,2 ± 0,2 kcal/mol; константа на афинитет беше 2,4 ± 0,2 х 10 6 М -1. Ова резултираше со вредност на К Д од 420 nm.Податоците прикажани со црвена боја одговараат на титрацијата на TtSlyD со GdCl 3. Не може да се утврди врски на Gd 3+. B Изотермална титрација од 27 µm TtSlyD со 270 µm ZnCl2 (во 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). Енталпијата на реакција ослободена со врзување беше овде -10,0 ± 0,1 kcal/mol; константа на афинитет беше 9,8 ± 1,5 x 10 6 M -1. Резултирачката вредност на К Д беше 102 нм. 145

Додаток Сл. 8-6 NMR титрација на 15 N-SlyD * со природна RNase T1 (S54G/P55N) во 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, pH 7,5 на 25 C. Промената во хемиската смена на некои вкрстени врвови се заснова за неспецифични интеракции на неструктурираниот дел од C-терминалот и ознаката His 6. Сл. 8-7 Откриена флуоресценција титрација на Tat27 со SlyD * во 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, pH 7,5 на 25 C. Цврстата линија одговара на прилагодување кон едноставен модел на врзување со едно место на врзување. Стоихиометрија од 1 резултира со константа на дисоцијација од 0,5 ± 0,1 μm. Аминокиселинска секвенца на пептидот Тат: QRRDFLKYSVALGVASALPLWSRAVFA. 146

Додаток Сл. 8-8 Титрација на 15 N-SlyD * со RCM-T1. Зависност од промената на хемиската промена од односот на концентрација RCM-T1 до SlyD * (A) и од концентрацијата на подлогата RCM-T1 (B) за двата амидни протони на D88 и S26 од титрацијата на NMR. А Кривата на врската за рамнотежа се добива од линеарно вклопување. Точката на еквивалентност е околу 1 и означува комплекс 1: 1. Б Цврстите линии се наменети само за насочување на окото, но немаат физичко значење. C Откриена флуоресценција титрација на RCM-T1 со SlyD *. Цврстата линија одговара на прилагодување кон едноставен модел на врзување со точка на врзување. Стоихиометрија од 1 резултира со константа на дисоцијација од 4,4 ± 0,8 μm. Двете титрации беа извршени во 50 mm Na 2 HPO 4, 100 mm NaCl, pH 7,5 на 25 C. 147

Додаток Сл. 8-9 1 H/15 N-FHSQC спектар на изолираниот IF домен во присуство на 0,5 M (NH 4) 2 SO 4 на 25 C. Напречните врвови на расплетените видови главно се наоѓаат во средината на Спектар од 7,8 до 8,4 ppm. Интензитетот на дисперзивните сигнали на структурираниот вид е приближно 30%. Сл. 8-10 Секвенца од 1D 1 H спектра од 450 μm инсулин по почетокот на реакцијата на агрегација на 25 C со додавање на DTT. Прикажана е областа со ниско поле со неколку сигнали од амидни протони на ланецот А. 148

Додаток Сл. 8-13 1 H/15 N-хетеронуклеарна NOE на 14,2 T и 25 C за SlyD * (црна) и SlyD * -Y68W (црвена). Различната динамика на двата домени во двата протеини може јасно да се забележи на временската скала на накосекунда пикобис NMR; доменот IF е многу пофлексибилен од доменот FKBP. Во областа околу W68, мутанот покажува зголемена динамика. Податоците за хносите беа kindубезно достапни од Мајкл Коверман. Сл. 8-14 Термодинамичка стабилност на SlyD * наспроти GdmCl. Развојна транзиција на SlyD * предизвикана од GdmCl во 10 mm Tris, ph 20 C 7,5 на 20 C (A) и во 10 mm Bis-Tris, ph 10 C 6,0 на 10 C (B). Цврстите линии претставуваат прилагодување на податоците во дво-состојба со следниве параметри на стабилност: GU (H 2 O) = 15,3 ± 1,4 kj/mol, m eq = 13,7 ± 1,1 kj/(m mol) и [D] 1/2 = 1,1 M (ph 7,5, A) или GU (H 2 O) = 12,0 ± 0,8 kj/mol, m eq = 13,0 ± 0,6 kj/(m mol) и [D] 1/2 = 0,9 M (ph 6,0, B). Концентрацијата на протеинот беше 2 μm (A) и 5 ​​μm (B). Грешките произлегуваат од прилагодувањето на податоците во равенката [2.10]. 150

Додаток 10 9 8 7 6 5 1 H (ppm) Сл. 8-15 1 H спектри на SlyD * во 10 mm Tris, ph 20 C 7,5 во присуство на GdmCl. Јасно се гледа ниската резолуција и интензитетот на сигналот во присуство на GdmCl (0,4 М GdmCl (црвен спектар) и без GdmCl (син спектар)). 151 година

Додаток Сл. 8-16 рангирана парцела за превиткување на RNase T1 (S54G/P55N). Редослед од 1D 1H спектри од 1,9 mm RNase T1 (S54G/P55N) во отсуство (A) и присуство на 190 μm SlyD * (B). Прикажан е регионот на ниско поле со регионот на амид протон. Временската резолуција по спектар беше 5 мин. 21 секунди, бидејќи четири последователни спектри беа просечни за да се подобри односот сигнал/шум. 152