Проценка на микроваскуларната функција на човечките масни ткива со помош на протокол за видеоемикроскопија

Резиме

Видеомикроскопски системи се користат за проучување на функционалните својства на изолираните артериоли на масното ткиво како одговор на физиолошките и фармаколошките стимули. Оваа техника може да се искористи за да се испитаат микроваскуларните фенотипови во различни домени на масното ткиво кај дебелите луѓе.

Апстракт

Вовед

Нашата лабораторија применува видеомикроскопија за да ја испита врската помеѓу дебелината и васкуларната дисфункција, со акцент на ефектите на различните домени на масното ткиво врз васкулатурата. Централната дебелина со акумулација на интраабдоминална висцерална маст е најверојатно поврзана со производство на адипоцитокин, метаболички нарушувања и кардиометаболен ризик. Се претпоставува дека дисфункција на масното ткиво со прекумерна продукција на про-атерогени цитокини и дирегулација на адипокин се силно вклучени во овие процеси, но одредени регулаторни молекули и цели на третман во голема мера остануваат незабележани. 4 Патем, на локално ниво на масно ткиво, истенчување на капиларите и нарушен проток на крв се поврзани со псевдохипоксија на масното ткиво и метаболна дисрегулација. Хипотезата дека кардиоваскуларните болести се развиваат веројатно резултат на дисфункција на масното ткиво. Про-атерогените медијатори ослободени од маснотии, особено во асоцијација со средна/висцерална дебелина, веројатно промовираат ендотелијална дисфункција и патогени васкуларни промени кои можат да се манифестираат локално во масното васкулатура и откривање со употреба на опишаната методологија овде. 5

Функционалната проценка на изолираните артериоли на масното ткиво е корисен пристап за разбирање на патофизиологијата и молекуларните механизми кои придонесуваат за васкуларна дисфункција во човечката дебелина. За да ги испитаме механизмите што придонесуваат за дисфункција специфична за масното депо, користевме методи за тестирање на одговорите на вазодилататорот зависен од ендотел и независен од микроваскулатурата и го вреднува изразувањето на различните регулаторни кандидати во споени висцерални и поткожни (масни материи) примероци на масно ткиво Дебели субјекти во моментот на примање на баријатриска операција.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Протоколот и примерите опишани овде беа одобрени од Одборот за медицински преглед на Факултетот за медицина на Универзитетот во Бостон (IRB, Протокол # H-25644) и беа направени во согласност со Декларацијата за Хелсинки. Сите субјекти дадоа писмена согласност пред учеството.

1. Подгответе ги растворите и микро-стаклените канили

2. Подгответе ги реагенсите

  1. подгответе ацетилхолин (ах, 10 -2 М, раствор на резерви). Растворете 18,29 g во 10 ml дејонизирана вода. Заштедете 1 ml парчиња од растворот (10 -2 M) на -80 ° C Сериски разреден на денот на експериментот за да се добијат следните работни концентрации: 10 -5, 10 -9, 10 -6, 10 -7, 10 -8 ул.
  2. Подгответе папаверин (2 x 10 -2 M, раствор на резерви). Растворете 0,07517 g во 10 ml дејонизирана вода. Подгответе 10 μL дел од резервниот раствор и сериски разредете на -80 ° C за да добиете 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7 10 -8 М на денот на експериментот.
  3. Подгответе го ендотелин-1 (ЕТ-1, 2 х 10 -5 М, раствор на залихи). Растворете 50 µg ендотелин-1 во 1 ml 1% BSA/PBS. Заштедете 1 ml количини од залиханиот раствор (2 x 10 -5 M) на -80 ° C. Разредете го денот на експериментот за да добиете работна концентрација од 10 -10 M на денот на експериментот.
  4. Чувајте реагенси или во -20 ° C или до -80 ° C во зависност од видот на замрзнувачот што е достапен, но не подолг од 6 месеци.

3. Собирање на масно ткиво и подготовка на садови

4. Проценка на дебелите микроваскуларни функции

Забелешка: генерално, вазодилатацијата зависна од масното артериоларно ендотелје може да се предизвика како одговор на физиолошки (предизвикани од проток) и фармаколошки стимули (предизвикани од Ах).

  1. Вазодилатација со посредство на проток, зависна од ендотел
    1. по притисок, снимете го дијаметарот на масната артериола во мирување (Ди). Ова се нарекува основен дијаметар на одмор.
    2. Пред крвните садови се стеснуваат,

    55% од почетниот дијаметар на мирување (Dp) со додавање на 1 μL ендотелин-1 (ЕТ-1, 10-10 М) директно во кадата и чекање 5 мин. Повторете го овој процес додека не го постигнете посакуваниот

    5. Анализа и пресметка на податоците

    1. пресметајте ја васкуларната реактивност. Користете процент на вазодилатација за отпечаток на податоците, разгледајте ги основните разлики во дијаметарот на садот и пресметајте ја следната равенка:
      % Вазодилатација (DT-Dp/Di-Dp) x 100 =
      каде DT е забележан дијаметар во одредена точка (максимален дијаметар), Dp е дијаметар снимен по додавање на агенс за вазоконстрикција (т.е. ЕТ-1 предизвикан стеснет дијаметар), а Di е дијаметар кој бил непосредно пред додавањето на агенсот за вазоконстрикција (почетен дијаметар на одмор) евидентиран. 9
    2. Дефинирајте ја вазодилатацијата и чувствителноста на вазоконстрикција (одговор на дозата) на агонист како концентрација на Ах, Папаверин или ЕТ-1 што предизвикува 50% од максималниот одговор (ЕГ 50) дефиниран со сигмоиден параметар и исцртан како што е претходно опишано. 10
      ЗАБЕЛЕШКА: меѓунабverудувачките студии за репродуктивност на вазодилатацијата на масните микросхеми има висок коефициент на корелација (CC) од 0,99 (n = 10 експерименти со Шиф) во нашата лабораторија.

    1. Изразете ги континуираните мерења како ± СЕМ, значи дека тие обично се дистрибуираат. Анализирајте ја васкуларната реактивност кај масните артериоли со повторено дејство двонасочна ANOVA.
    2. Алтернативно, споредете ја областа под кривата на дејството за кумулативна вазодилатација со одговорите на дозата помеѓу групите за третман. Во сите случаи, размислете за задолжителна претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    Нашата лабораторија користеше видеомикроскопија за да ја испита вазодилатацијата зависна од ендотелот и независна, како и вазоконтрактилната функција на масното ткиво, изолираните артериоли од поткожното и висцералното масно ткиво од дебелите луѓе. Карактеристичното експериментално поставување е прикажано на слика 1Априкажани. Артериолите на масното ткиво се суспендирани помеѓу две капиларни стаклени пипети и прицврстени со конци во рамките на органската комора, како на слика 1бприкажано. Како што е опишано погоре во Дел 5.1, артериоларните одговори може да се проценат со испитување на садот на почетокот (Слика 2А), проследено со претходно стеснување со ЕТ-1

    55% од почетниот дијаметар (Слика 2 б) и потоа вазодилатација предизвикана од агонист и релаксација на васкуларниот лумен како на слика 2прикажано.

    функција
    Слика 1: Структура на видео микроскопија. (А.) Слика што ги отсликува компонентите на органската комора на видеоемикроскопија. (Б.) Слика на артериола на човечко масно ткиво монтирана помеѓу две стаклени капиларни пипети во органската комора. Дијаметарот на Шиф се менува како одговор на физиолошките и фармаколошките стимули, кои можат да се испитаат и да се измерат со помош на софтвер за анализа и додаток на превртена камера специјализиран за системот. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

    човечките
    Слика 2: Визуелизација на микроваскуларна вазодилатација со видео микроскопија под притисок. (А.) почетен дијаметар на артериоли (дијаметар после притисок, без агонист или стимулација: Вторник) (Б.) веќе стеснети дијаметри (индуцирани стеснети дијаметри по ET-1: Dp), (Ц.) Агонистичко-индуцирано намалување на дијаметарот (откако беше додаден Ах: ДТ). Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

    човечките
    Слика 3: Ендотелиум-зависна и -зависна вазодилатација кај поткожни наспроти висцерални артериоли на масното ткиво кај луѓе со прекумерна тежина. Вазодилатацијата зависна од ендотел е значително ослабена во висцерална во споредба со поткожните масни артериоли со (А.) Проценка на зголемениот проток (спарени поткожни и висцерални садови, n = 20) или (Б.) Одговор на дозата на ацетилхолин со/без L-NAME (спарени поткожни и висцерални садови, n = 16). (Ц.) Вазодилатацијата независна од ендотел не се менува различно помеѓу висцералните и поткожните артериоли при проценка на одговорот на дозата на папаверин (спарени поткожни и висцерални садови, n = 8). * Ги означува групните разлики помеѓу складиштата; † Означува депо-специфични разлики помеѓу ацетилхолин со L-NAME во споредба со ацетилхолин сам; НС: не е значајно. Податоците се презентираат како Средно ± СЕМ, потребно е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Дисекцијата и изолацијата на дебелите артериоли од околните ткива може да биде процес временски и трудоинтензивно со внимателно внимание на деталите и техничкиот протокол. Постапката за микродитекција бара внимателни вештини и специјализирани реквизитни реквизити со цел да се избегне можно оштетување на мазните мускули или ендотелните слоеви на клетката на микроваскулатурата. Дури и најмалата случајна пункција во артериоларниот wallид може да спречи интралуминална притисок и да резултира во неуспешен обид. Покрај тоа, канилацијата на артериолите со конци е клучна за да се обезбедат артериолите помеѓу врвовите на стаклесто-капиларната пипета на секој крај од садот.

    Хумани изолациони микроцеда може да развие спонтан миоген тон по 30-40 мин притисок под притисок на 60mmHg. Сепак, откривме дека големината на човечките масни артериоли вообичаено 50-350 μm внатрешен луминален дијаметар е релативно мала со ретки слоеви на васкуларни мазни мускулни клетки и немаат тенденција да развиваат значителен миоген тон во споредба со артериолите на скелетните мускули. Така, ние предизвикуваме пред-стеснување на овие мали артериоли со ЕТ-1 пред изложеност на вазодилататори. Откриваме дека ЕТ-1 врши посигурен одговор на вазоконстриктор, додека во некои случаи може да има варијабилност во одговорите на агонисти на алфа рецептори како што е фенилефрин. Потребно е да се користи соодветен агонист за да се предизвика посакуваниот

    55% пред-врат да се избере; Сепак, исто така е важно да се избере точната количина на средство за пред-стегање во однос на дозата и да се спречи токсично оштетување на садот. За да го постигнеме ова, започнуваме со редот на долната доза и титрираме нагоре, како што е опишано во делот 4.1.2.

    Артериолите во масното ткиво се чувствителни на промени во pH и температурата; 14 затоа е клучно да се следи и контролира соодветната pH вредност (7,4) и температурата (37 ° C) за време на експерименталната постапка. Додека видеомикроскопијата е строго контролирана температура контролирана, императив е да се набудува pH вредноста на растворот во експериментот за да се избегнат смени што можат да ги искриват резултатите. РАК. Континуираните меури на растворот КАНЦЕР и растворот за замена на секои 15 минути за време на чекорите на притисок и перење ќе ги намалат флуктуациите на pH со текот на времето.

    Видеомикроскопија е корисна техника за проучување на функционалните својства на микроваскулатурата, техниката има значителна крива на учење и потенцијално напорна работа, особено за време на процесот на изолација на крвните садови. Во зависност од видот на ткивото што се биопсионира, нашето искуство со микроваскулатурата на масното ткиво покажа дека постапката на канилација може да потрае значително време и трпеливост. Покрај тоа, постои својствена временска чувствителност на експериментите, бидејќи садовите надвор од телото со текот на времето ги губат своите физиолошки и функционални својства. Така, експериментите мора да се извршат во рамките на одржливите прозорци на садовите неколку минути до часови по хируршката биопсија пред какво било распаѓање на ткивото.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Откривање

    Авторите немаат детали или судир на интереси за да пријават.

    Признанија

    Авторите би сакале да им се заблагодарат на волонтерите за учеството во овие студии и на персоналот на операционата сала во Медицинскиот центар во Бостон за обезбедување биопсии на масното ткиво. Д-р Gökce е поддржан од грантовите на Националниот институт за здравство (NIH), HL081587, HL114675 и HL126141. Д-р Бојата се потпира на грантот за NIH K23 HL135394.