Производство на чиста култура - микробиолошка пракса

Во овој експеримент, треба да се применат различни техники на размачкана размачка (метод со 13-линија и 3-јамки) и да се тестираат со цел да се добијат чисти микробиолошки култури.

Метод на размачкување со 3 циклуси:
И овде, јамката за инокулација се заварува и се лади на работ на плочата што треба да се инокулира пред да се земе инокулумот од примерокот што треба да се разреди. Јамката за инокулација се става лесно на агарот и потоа се шири од работ до работ, но без да го допирате, со „цик-цак движење“ до околу една третина до половина од плочата. Јамката за инокулација повторно се запечува, се лади, садот Петри се врти за приближно 90 °, а потоа се става размачкана маса, така што материјалот се става зад првото размачкување, материјалот се подига со него со лизгање над него и овој материјал продолжува низ плочата се дистрибуира уште едно „цик-цак движење“. Јамката за инокулација повторно се запечува, се лади, садот Петри се врти за приближно 90 ° и се применува трето размачкување, аналогно на постапката за второто размачкување. Следната скица има за цел да ја илустрира техниката на линијата со 3 дупки уште еднаш:

1 недела
Во овој експеримент, мешана култура на Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Rhodotorula glutinis со два различни методи на размачкување, методот со 13 линии и методот со три јамки, на три различни медиуми за култура (HPG, KB и YGC агар), се изведуваат фракционирани размаски. За таа цел, веќе истурените и готови за употреба агарски плочи први беа обележани на долната страна на садовите Петри.
Хранливите материи го имаа следниот состав:

Агар ХОП
за 1000 ml аква демин. беа додадени:

5,0 гр екстракт од квасец
5,0 гр пептон од месо
0,25 g гликоза
15 гр агар

PH вредноста беше прилагодена на 7,2.

YGC агар
за 1000 ml аква демин. беа додадени:

5,0 гр екстракт од квасец
20,0 g Д (+) глукоза
0,1 g левомицетин
14,9 гр агар

PH вредноста беше прилагодена на 6,6.

Агар на кралот Б (KB)
за 1000 ml аква демин. беа додадени:

20,0 g протеаза пептон
10,0 г глицерин (чист)
1,5 g магнезиум сулфат (MgSO4)
1,8 g 3-хидрат три-калиум фосфат (K3PO4 × H2)
15,0 g агар

PH вредноста беше прилагодена на 7,1.

Од секоја од агарните плочи наведени, една се инокулираше со методот на 13-линија и една со методот на три-линија, така што се добиени 6 агарни плочи. За таа цел, клеточната суспензија е обезбедена со мешана култура на Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Rhodotorula glutinis Добро измешајте со миксер за епрувета, а потоа изладете ја пржената инокулациска јамка на работ на плочата агар КБ и земете инокулум од суспензијата и нанесете ја на агарската плоча со методот 13-линија. Агарот ХЕПК и агарот YGC исто така беа инокулирани со инокулум од мешаната култура со употреба на методот од 13 линии. Мешаната култура потоа се размачка со користење на методот на размаска со 3 јамки, агарот KB, YGC и HPG се инокулира еден по друг со јамката за инокулација. Инокулираните агарски плочи сега беа инкубирани наопаку: плочите HPG за 2 дена на 25 ° C, плочите YGC на 25 ° C. околу 5 дена и KB плочите на 25 ° C. за 3 дена.

3 недела
Во третата недела беше спроведена контролата на бришењето на серијата бришења, повторно обрнувајќи внимание на хомогеноста, изолацијата и морфолошките карактеристики на колониите, како и контаминацијата.
Во следниот чекор чиста култура на Pseudomonas fluorescens подготвена една култура на агар и секоја криокултура.
Обезбедената закосена цевка беше исполнета со агар ХЕПК (составот види горе) и криомедиумот го имаше следниот состав:

Криомедиум

0,5 ml хранлив раствор
0,5 ml 85% глицерин
3 стаклени зрна (од занаетчиски материјали)

Хранливиот медиум содржан во криомидиумот го имал следниот состав:

Хранлива средина
за 1000 ml аква демин. беа додадени:

5,0 гр месо пептон
3,0 гр екстракт од месо

PH вредноста беше прилагодена на 7,0.

5-та недела
Во петтата недела, сите плочи беа испитани макроскопски и проверени за чистота, хомогеност и контаминација. Покрај тоа, сите агарски плочи биле испитани за флуоресценција под УВ ламбата (366 nm). Некој клеточен материјал беше суспендиран од брисењето на криокултурата врз агарот ХЕПК и инокулумот се нанесуваше на исчистен слајд на микроскоп и овој брис, по сушењето, беше микроскопски зголемен 400 пати на светло поле (види 4-та недела). Плочата агар KB од размаска на културата на коси агари и агар плочата HPG од криокултурата беа издвоени и користени за тест со каталаза во експериментот Д2.

2 недели
Растот на индивидуалните микроорганизми се развивал поинаку: агарот YGC бил претежно со Rhodotorula glutinis, KB агарот претежно со Pseudomonas fluorescens и агарот ХЕПК претежно со Bacilus subtilis обрасната.
Контролата на размачкување на агарните плочи HPG, YGC и KB во методот на размаска со 3 циклуси и 13-линија ги произведе резултатите прикажани во следните табели:

Таб. 3: контаминација Агар: KBYGCHPG

+: контаминација -: нема контаминација Презиме: Име на загадувачот
Метод со 13 редови:	+	P. fluorescens	+
Размаска со 3 јамки:	-	+	-

Резултатите од карактеризацијата на морфологијата на колонијата се претставени во следната табела:

Таб. 4: Колонија морфологија Дијаметар на боја, облик и рангирање Профил на површината Конзистентност Промена на бојата на културата

YGC: Rhodotorula glutinis	црвено	1-2 мм	круг	мазна	конвексни	мазна, сјајна	путер	-
KB: Pseudomonas fluorescens	Бело	1-4 мм	круг	мазна	рамни	грубо	како гел	-
ХПК: Bacilus subtilis	Бело	1-2 мм	круг	мазна	конвексни	мазна, сјајна	лигав	-

3 недела
Контролата на размачкување на втората размачкана разредување на агар ХОП го даде следниот резултат:

Rhodotorula glutinis: контаминирани (загадувачи) Ризобиум Спори), добра изолација на колониите
Pseudomonas fluorescens: контаминирани (загадувачи) Ризобиум Спори), без изолација на колониите
Bacillus subtilis: нема контаминација, добра изолација на колониите

4-та недела
Проверка на чистотата на агар коси културата на Pseudomonas fluorescens го даде следниот резултат:

Флуоресценција: Добро
Макроскопска хомогеност: Добро
Микроскопска хомогеност: Добро

5-та недела
Контрола на размачкување на криокултурата и закосената култура на Pseudomonas fluorescens на агарот КБ и ХПЦ го дадоа следниот резултат:

Наклон на агар КБ: флуоресцентна, макроскопски хомогена, без контаминација
Агар наклон на ХПГ: флуоресцентна, макроскопски хомогена, без контаминација
КБ крио: флуоресцентни, макроскопски хомогени, контаминирани со РизобиумХРП крио: флуоресцентни, макроскопски и микроскопски хомогени, без контаминација

Исто така, беше откриено дека жолтата боја на колониите е поизразена на агарот КБ отколку на агарот ХПЦ. Растот на плочите на криокултурата беше исто така посилен отколку на бришењето на културата на агар.

Бил:
За глицерин (C3H8O3) е дадена маса од 10 g.
Моларната маса на C3H8O3 произлегува од:
(12u * 3) + (16u * 3) + (1u * 8) = 92u 92 g/mol
Масата од 10 g на 1 l резултира во моларна концентрација од:
10 g/92 g/mol = 0,1086 mol/литар

За три-калиум фосфат-3-хидрат (K3PO4 x 3 H2O) е дадена маса од 1,8 g на 1000 ml.
Моларната маса на K3PO4 x 3 H2O произлегува од:
(39u * 3) + (31u * 1) + (16u * 4) + (6u * 1) + (16u * 3) = 266u 266 g/mol
Затоа, масата од 1,8 g на l одговара на моларна концентрација од:
1,8 g/266 g/mol = 0,0677 mol/литар

За сулфат на магнезиум MgSO4 е дадена маса од 1,5 g на 1000 ml.
Моларната маса на MgSO4 произлегува од:
(24.3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) = 120.3u 120,3 g/mol
Затоа, масата од 1,5 g на l одговара на моларна концентрација од:
1,5 g/120,3 g/mol = 0,0125 mol/литар

Во овој експеримент, активноста на каталазата кај различните бактериски култури (Pseudomonas fluorescens и млечна киселина бактерии).

Кислородот во својата молекуларна форма како О2 молекула има токсичен ефект врз сите живи клеточни системи поради неговото оксидативно дејство и е познат и како клеточен отров. Ова важи уште повеќе за анаеробните организми, бидејќи тие не користат кислород како приемник на електрони на респираторниот ланец и затоа не можат да го направат безопасен во форма на вода (H2O). Активирањето на кислородот може да добие 3 различни форми, сите се катализирани од таканаречените оксидази и во кои се формираат следниве меѓупроизводи:

O2 + 4 e - -> O 2- + O 2- оксидни јони
O2 + 2 e - -> O2 2- јонски пероксид
O2 + 1 e - -> O2 - јон супероксид

За овие јони на кислород, она што се најде за молекуларен кислород важи во уште поголема мера: Тие се многу реактивни реактанти кои можат трајно да ги оштетат клетката и нејзините компоненти. Ова е причината зошто повеќето организми имаат ензимски системи што ги прават безопасни меѓупроизводите што произлегуваат од намалувањето на кислородот. Оксидните јони реагираат со протони и формираат вода, која е безопасна за клетката, јоните на пероксид реагираат со протоните H + и формираат водород пероксид (H2O2), што е исто така многу реактивно и штетно за клетката. Супероксидниот јон реагира со водород пероксид и водородни протони и формира молекуларен кислород, вода и хидроксил радикал, што пак е токсично за клетката. Последователните реакции на активирање на кислород се наведени повторно подолу:

Со цел да се направи хидроген пероксид безопасен, повеќето аеробни организми имаат ензим каталаза, кој го разложува H2O2 во вода и молекуларен кислород:

Исто така, постојат пероксидази кои можат да детоксифираат водород пероксид со протонирање:

Со цел да се избегне формирање на хидроксилни радикали, аеробните и аеротолерантните организми имаат ензим супероксид дисмутаза, кој го претвора јонскиот супероксид од активирање на кислород во нешто помалку штетен водород пероксид и молекуларен кислород:

Анаеробните организми обично ги немаат овие ензимски системи.
Реакцијата на каталаза се користи за карактеризирање на микроорганизми со набудување на еволуцијата на гас од молекуларен кислород во организми кои го поседуваат овој ензим. Оваа реакција може да се искористи за да се направи разлика помеѓу аеробни и анеробни, а најмногу од аеролерантни организми. [2]

Во овој експеримент се користеа издвоените агарски плочи на размаски Pseudomonas fluorescens од експериментот Д1 (агар од КБ од арангетската култура на агар и плочата од агар ХЕПК од криокултурата), како и агарните плочи од бришењата на млечните киселински бактерии од експериментот Н (агар М17 со Стрептокок и агор Рогоса со Лактобацилус) подложен на тест за каталаза. За таа цел, првиот од агарните плочи беше ставен директно на лабораториската маса, капакот на садот Петри беше отстранет и 3% раствор на водород пероксид (H2O2) достапен од мала колба Ерленмаер беше истурен врз него, така што агарот беше рамномерно покриен со течноста. Сега кратко се чекаше да се види дали има развој на гас во течноста над агарот и резултатот беше забележан. Сите агарски плочи беа тестирани со иста постапка. Испитаните агарски плочи беа фрлени во отпад од автоклав.

И тестот за каталаза со агарот KB на културата на коси агари и агарот HPG на криокултурата беа позитивни, т.е. визуелно се забележува силна еволуција на гас, што се карактеризира со насилно пенење и формирање меур на течноста. Двете агарски плочи (агар М17 со Стрептокок и агорот Рогоса со Лактобацилус) на експериментот H не е пронајдена никаква еволуција на гас.

Како резултат на овој експеримент може да се наведе дека Pseudomonas fluorescens Каталаза-позитивна и затоа има заштитен ензим каталаза, додека млечна киселина бактерии Стрептокок и Лактобацилус Дали каталазата е негативна и немаат ензим каталаза. Така може Pseudomonas fluorescens класифицирајте како аеробен организам и млечна киселина бактерии како барем аеротолерантни, па дури и анаеробни организми.
Исто така, треба да се напомене дека добиениот гас исто така може да се собере и да се подложи на понатамошни испитувања за да се потврди дали тој всушност е кислород (О2).