Просторна квантификација на лекови во лезии на пулмонална туберкулоза со помош на микродисекција со ласерско снимање

Резиме

Овде опишуваме протокол со користење на микродитекција на ласерско снимање, поврзана со анализа на LC/MS за да се измерат дистрибуциите на просторни лекови во грануломите на белодробната туберкулоза. Овој пристап има широка применливост за да се измери концентрацијата на лекот во ткивата со високи просторни детали.

Апстракт

Вовед

Способноста за просторно решавање и квантифицирање на нивото на лекот е од суштинско значење за да се утврди дали лековите против туберкулоза достигнуваат бактериски субпопулации во белодробни лезии при концентрации на стерилизација 1. Од особена важност е пенетрацијата на лекот во некротичното јадро на лезијата (наречена казеум), одредувајќи која обично содржи најголем број бацили и евентуално слабо достапни лекови поради недостаток на васкуларизација.

Традиционалните методи на пенетрација на лезијата, оценувајќи ја хомогенизацијата на исечените белодробни лезии, проследено со екстракција на растворувач и анализа на течната хроматографија-масена спектрометрија (LC/MS), се многу чувствителни и селективни за лековите од интерес. Сепак, овие методи обезбедуваат слаби просторни информации, ограничени на големината на оригиналното хомогенизирано ткиво. Пристапи за сликање базирани на масовна спектрометрија, како што се јонизација на ласерско десорпција со матрица (MALDI) 2, 3, јонизација со електроспреј за десорпција (DESI) 4 или екстракција на површинска течност со проширување на течности 5, 6 нудат многу просторно решени способности за сликање, но директната квантификација може да биде исклучително тешка или невозможно заради хетерогени ефекти на супресија на јони и различна ефикасност на екстракција на аналити од одделна клетка или ткиво 7. Покрај тоа, повеќето пристапи за слики на директни ткивни МС се инхерентно помалку чувствителни од ЛЦ/МС поради недостаток на хроматографско одделување на ендогени видови кои се натпреваруваат за јонизација и пониска ефикасност на екстракција на растворувач на лекот од ткиво.

Овој протокол ја опишува моќната комбинација на просторно профилирање и целосна квантификација на LCM-LC/MS, нудејќи апсолутни концентрации на лекови во сите оддели на понудените грануломи за ТБ. Техниката, исто така, може да се примени за да се утврдат концентрациите на лекот во многу различни заболени ткива за да се информираат за виталното откривање и развој на лекот.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Целото тестирање на животни беше извршено според Водичот за грижа и употреба на лабораториски животни на Националниот институт за здравство со дозвола од Комитетот за грижа и употреба на животни на NIAID (NIH), Бетесда, М.Д.

(1) Испитување на животни и собирање ткива

Овој дел од протоколот ги опишува процедурите на животните и условите за собирање примероци на ниво на биосигурност 3 (BSL3). За детални протоколи на постапката за инфекција со аеросол на микобактериум туберкулоза и администрација на лекови, протоколите кај зајаци беа опишани претходно 11, 12 .

(4) Извлекување и анализа на LCMS

5. валидацијата на методот

Создадете хомогенат во контролата на белодробното ткиво со комбинирање на 1 дел од белите дробови, 2 дела PBS и 3-4 челични зрна. Победете го белодробното ткиво и PBS пуферот 5 минути на 1750 вртежи во минута со хомогенизатор на мушка.
Скокни хомогенат со додавање на 10 μL од 1 mg/mL етамбутол DMSO залихи во 990 μL хомогенат за да се создаде крајна концентрација од 10 000 ng/mL (10 mg/mL) и вител за 1 минута.
Создадете замрзнат хомогенат блок со истурање на хомогената во Криомолд и брзо замрзнување на сув мраз 5 минути.
Подгответе делови од дебелина од 25 µm од блокот на хомогената како што е опишано во 2.1-2.5.
Расечете го целното ткиво како што е наведено во чекорите 3.2-3.10.
Додадете 10 μL 1: 1 ацетонитрил/вода и 2 μL PBS пуфер во цевките со микродисецирано ткиво.
Додадете 50 µL од растворот за екстракција во секоја цевка. Чекори за создавање на стандардна крива и одредување на концентрацијата на лекот во блокот на хомогенатот на ткивата 4.9-4.12.
Пресметајте ја ефикасноста на екстракција користејќи ја следнава формула:

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Преглед на пристапот LCM-LC/MS е прикажан на слика 1прикажано. Откако ткивото е стерилизирано со гама зрачење, сите понатамошни чекори (отсекување на ткивото) се одвиваат надвор од BSL3 условите. Слика 2 ги покажува деловите за биопсија на лезијата пред и по ткивото изолирано од ЛКМ. Некротичните и клеточните области на лезиите на ТБ може лесно да се идентификуваат и изолираат само со визуелна инспекција на оптичките слики (без барање за упатување на соседните ткива со хистолошки обоени делови). Процесот на дисекција создава чист засек со минимално нарушување на околното ткиво, а дисецирањето на 3 милиони μm 2 (3 mm 2) од секој регион од интерес од лезии трае приближно 1 час вкупно.

Ние применивме квантификација на LCM-LC/MS просторно - многу постоечки и нови анти-ТБ лекови во рамките на белодробните лезии. Слика 3А покажува примерок од податоците од заразени со МТБ дозирана стабилна состојба со етамбутол. LCM-LC/MS овозможи целосна квантификација на лекот во рамките на растворени казеум, клеточна лезија и неразвиени области на ткивото на белите дробови. Забележано е дека ЕМБ продира во лезијата, како и да достигне концентрација на стерилизација во рамките на некротичниот казеум. Соодветната слика MALDI-MS стекната со продажба на ЕМБ од соседното ткиво е прикажана на слика 3б. Квалитативните слики на MALDI-MS добро корелираат со квантитативните податоци за LCM-LC/MS со пониски концентрации на лекови откриени во некротичното казеум во споредба со клеточниот раб. Податоците за LCM-LC/MS беа потврдени со директна споредба со ткивни хомогенити анализирани со стандардни LC/MS.

илустрација 1 : Шематски процес LCM-LC/MS. Бипсиите на белите дробови на зајачицата со некротични лезии, заедно со околните неинволвирани бели дробови се собираат и замрзнуваат. Криосекциите се сечат на тенки ПЕТ-мембрани и се вклучуваат неразвиените белодробни, клеточни и казеозални лезии и се изолираат за квантификација со LC/MS. адаптирано од Зимерман и др. 12 Кликнете тука за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 2 : Лезија (A, B) и неинволвирано белодробно крило (C, D) бидејќи тие се појавуваат под микроскоп пред (A, C) и после (B, D) микродесекција. Областите на лезиите на Казеоза се појавуваат потемни и „распукани“ при скенирање на оптичката слика (А, зелена контура). Клеточната лезија има полесна боја и има поцврста структура (А, црвена граница). Неинволвираните бели дробови треба да се палпираат оддалечени најмалку 5 mm од границата на лезијата и да имаат црвена/розова боја (C, цијан преглед). Скалирани шипки (црна, сина и виолетова) = 400 μm. Забележете дека треба да се изберат само области на неинволвирани бели дробови за да се избегне вклучување на алвеоларните простори и бронхиолите зафатени на целата површина на ткивото (види г). Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Дисецирана област (μm- 2)	ЕМБ конц. (Ng/g) измерен (n = 3)	Обнова на ЕМБ (%) (n = 3)
3 милиони	10633 (404 ±)	106 (± 4)
5 милиони	10057 (32 1132)	101 (± 11)
10 милиони	10563 (28 1128)	105 (± 11)

Табела 1: Ефикасноста на екстракција на методот LC-LC/MS за квантифицирање на ЕМБ во белите дробови. Целосно закрепнување на ЕМБ евидентиран е-ЕМБ-допиран хомогенат на расечено белодробно ткиво за сите проценети количини на ткива.

ID на зајак	LC/MS EMB (ng/g)	LCM-LC/MS EMB (ng/g)	Разлика (%)
899 година	2910 година	3320 година	14-ти
904 година	2010 г.	1870 година	-7-ми
911 година	2150 година	2370 година	9

Табела 2: Споредба на квантификацијата на ЕМБ на неинволвирана биопсија на белите дробови од 3 дозирани зајаци со употреба на LCM-LC/MS. и LC/MS Еквивалентни концентрации на лекови откриени со методи и не е забележано губење на сигналот со деградација или аспирација за време на процесот на LCM-LC/MS.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Просторно решена квантификација на лекови во рамките на белодробни лезии на ТБ е потребна за да се утврди дали изложеноста на лекот достигнува стерилизирачки концентрации на популации на бактерии кои живеат во различни оддели на лезии. Методот LCM-LC/MS опишан овде овозможува апсолутно квантифицирање на анти-ТБ лекови кај сите субјекти на лезијата, вклучувајќи го и казеумот богат со бактерии, со вкупно само 1-3 дел од ткивата. Традиционалната хомогенизација на ткивата и приодите на ЛЦ/МС за квантифицирање на лекот во ткивото честопати немаат просторни карактеристики за решавање на специфични оддели за лезии, па дури и кога тоа е можно, постои значителен потенцијал за меѓу-клеточна контаминација и области на некротични лезии за време на рачна екстракција.

Протоколите за боење на ткивата обично се користат пред LCM за апликации за протеомика за да се овозможи лесно идентификување на областите на ткивото и лоцирани во популации на клетки. Рутински хистохемиски дамки како што се Б. H&E не се компатибилни со квантификацијата на лекот бидејќи многу вклучени чекори за миење на растворувачи ќе го одведат лекот од ткивниот дел во друг. Соседните празни места можат да бидат обоени со H&E и да се користат како водич за микродесекција. Сепак, тоа обично не е потребно, бидејќи одделите за лезии можат да се видат под стандардниот микроскоп LCM светло поле (Слика 2) може да се реши.

Оптимизирање на чекорите на сечење и микродрекција е клучно за успешна квантификација на лезијата. За време на развојот на методот, оценивме два различни мембрански материјали, полиетилен терефталат (ПЕТ) и полиетилен нафталат (ПЕН) како подлоги за составување на ткивните делови за микродесекција. ПЕН мембраните претрпеа зголемени статички полнежи во споредба со ПЕТ мембраните и приближно 30% од сите области на расечените ткива се изгубија поради статичката привлечност помеѓу мембраната и регионот на расеченото ткиво. Од оваа причина, ПЕТ мембраните беа избрани за идните дисекции поради значително намалената статичка привлечност забележана (само 5% од регионите расечени од ПЕТ мембраните беа изгубени за време на ЗКМ).

Густината на дисецираните ткивни региони е исто така важен предвид при квантифицирање на нивото на лекот врз основа на површината или волуменот на ткивото. Ова е од особено значење за биопсиите на белите дробови и лезиите, во кои неинволвираните области на белодробното ткиво имаат вкупна помала густина од клетките и казеумот (помалку ткива што имаат иста релативна површина), поради присуството на повеќе отворени бронхиоли и алвеоларни простори. Ефектите од оваа разлика во густината може да се ублажат со внимателно разгледување на отворените области, вклучително и во акумулираната област на собрани ткива (како што е прикажано на слика 2)прикажано).

Друго ограничување е дека презентираниот метод LCM-LC/MS само ја квантифицира вкупната концентрација на лекот во изолираното ткиво (заедно со сите пристапи кон хомогенизација на ткивата, екстракција на растворувач и квантификација на LC/MS) и не ги раствора концентрациите на лековите поврзани со протеини од неврзани паузи. Микродализата е алтернативен пристап кон квантифицирање на неврзаниот лек во ткивото и овозможува точна квантификација на концентрациите на слободните лекови кои достигнуваат екстрацелуларни популации на бактерии Сепак, техниката најдобро ќе се примени како комплементарен пристап бидејќи нема просторни специфики на LCM-LC/MS и само ги квантифицира нивоата на растворливи лекови во хиерархијата на течноста вонклеточно ткиво, а не на интрацелуларната содржина.

За прв пат комбиниравме LCM и LC/MS за просторно да ги квантифицираме антибиотиците на местото на инфекција со туберкулоза. Методологијата е огромна моќна бидејќи може да се примени на кој било лек од мала молекула во која било фаза на болеста. Всушност, неодамна квантификувавме кандидат за антифунгални лекови во модел на глувци на абдоминална кандидијаза 14. Разделувањето на диференцијалните лекови во хетерогени оддели на тумори (вклучително и некротични јадра) е примарна грижа во третманот на рак и критична област на истражување за откривање на лекови за карцином 15. LCM-LC/MS е идеално прилагоден за пристап кон овие прашања. Покрај тоа, LCM-LC/MS е корисен за откривање на биомаркери за да се измерат метаболички, липидомични и протеомски промени што се случуваат во ткивните региони и клеточните популации за време на патогенезата на болеста.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.