Срцево фенотипизирање на глувци со недостаток на TASK-1 и Pannexin-1 - Бесплатно PDF
Срцево фенотипизирање на глувци со дефицит на ТАСК-1 и панексин-1 ИНАВГУРАЛНА РАСПОРЕДУВАЕ за да се добие диплома за Dr.med.vet на Одделот за ветеринарна медицина на Универзитетот „usагус Либиг“, Гисен Стела Шулте (роденден Петриќ)
Поднесено од Институтот за фармакологија и токсикологија на Универзитетот usастус Лиебиг Гисен, супервизор: проф. Јоаким Гејер и од Клиниката за детска кардиологија и пневмологија на Универзитетската клиника во Дизелдорф Супервизор: проф. Биргит Донер Срцевиот фенотипизација на глувци со дефицит на ТАСК-1 и панексин-1 ИНАВГУРАЛНА ДИСЕРСТАЦИЈА за да се добие диплома за Dr.med.vet на Одделот за ветеринарна медицина на Универзитетот Justастус Либиг во Гисен поднесен од ветеринар Стела Шулте (новороденче Петриќ) од Фрајбург Гижен 2016 година
Со одобрение на Одделот за ветеринарна медицина на Универзитетот usастус Либиг, Гисен Декан, проф. Д-р Мартин Крамер Рецензент проф. Д-р. Јоаким Гејер Проф. Ден на дискусија на Биргит Донер, 10.05.2017 година
Воведниот бран ја пресекува изоелектричната линија (Мичел и сор., 1998; Чавес и сор., 2003 година; Свингедау и Ауберт, 2003 година; види слика 1.6). R R R R P S Q R R R R Крај на Т-бран (крај на реполаризација) P S Слика 1.6: Рачна дефиниција на крајот на Т-бранот со глувчето. Изменето од Мичел и сор., 1998 Пресекот на Т бранот и изоелектричната линија е дефиниран како крај на реполаризацијата. П Физиолошкиот ритам на срцето на глувчето во мирување е околу 550-620 отчукувања во минута (мин. 1; Такума и сор., 2001; Кас и сор., 1998), што е значително повисоко од оној на луѓето со просек од 70 отчукувања во минута (Доевенданс и ал., 1998; Силбернагел и Деспопулос, 2003). Интервалите за PR, RR, QRS и QT се соодветно пократки кај глувците. Сумирајќи, може да се каже дека потенцијалите на акција и анатомската структура на срцето, како и изразот на јонскиот канал на двата вида, се разликуваат маргинално едни од други, но сепак во суштина дозволуваат резултатите од истражувањето да се пренесат од глушец на човек. Колку што знаеме, тој е секако најдобриот од сите можни системи за основно истражување во срцето. 9
Вовед 1.5.3 Употреба, развој и можности на нокаут глувци Прелиминарната работа за развој на нокаут глувци му ја донесе на Американецот Марио Капеки и неговите двајца британски колеги истражувачи Сер Мартин Еванс и Оливер Смитис Нобеловата награда за медицина во 2007 година. Досега, нокаут глувците се единствените суштества создадени во лабораторијата со употреба на трансгенски техники во кои еден или повеќе гени се успешно и специфично исклучени. Овие ја губат својата функција и им овозможуваат на истражувачите да извлечат заклучоци за нивната улога во (наследни) болести. Со нашите две линии за размножување, глувците панексин-1 и ТАСК-1, имаме такви нокаут-глувци достапни за експерименти. Како и да е, последното прашање за преносливоста на резултатите врз луѓето секогаш останува. 10
Вовед 1.5.4 Производство на нокаут глувци 1. Клеточна култура (ембрионални матични клетки, ЕС) Слика 1.7: Производство на нокаут глувци Изменето според Грав, 2007 година Целниот вектор е трансфектиран во клеточна култура на ембрионални матични клетки и хомологна рекомбинација инкорпорирани во ДНК на матичните клетки. Како резултат на пролиферацијата на променетите клетки, конечно се создава популација на клетки со изменет ген, која се инјектира во бластоцисти на глувци. Овие бластоцисти се вметнуваат во женски глувци преку трансфер на ембриони и се носат од нив.Глувците родени или носат исклучиво нормален (див тип) генетски материјал или, како т.н. мозаични глувци, половина се диви и половина се генетски модифицирани. Вторите се хетерозиготни. Задните крстови со хетерозиготни глувци на крајот резултираат во хомозиготни нокаут-глувци. 11
Вовед ES2-247 ES1-84 CE-395 CE-494 IS-169 CE-379 IS = Интрацелуларен циклус; ES = вонклеточна јамка; СЕ = карбокси терминален крај (броевите после секој ги прикажуваат аминокиселинските позиции на трансмембранските домени) Слика 1.9: Структурна споредба на трите различни панексини гени на глувчето Изменето според Пенуела и сор., 2009 Сите 3 гени на панексин на глувчето имаат 4 трансмембрански домени (секој со по 20 краеви на аминокиселина), како и 2 вонклеточни јамки и интрацелуларен карбокси- и амино-терминален крај. Карбокси терминалниот крај на панексин-2 е многу подолг од оној на другите два панексини. 1.6.2 Изразување и функција на панексин-1 Панексин-1 е единствениот од трите панексинински протеини што може да се открие насекаде (Барбе и сор., 2006); неговиот израз е особено силен кај еритроцитите, ендотелните клетки и астроцитите, каде што се ослободуваат од АТП (Ванг и сор., 2007). Неговиот израз во срцето на глувчето (Реј и сор., 2005; Нишида и сор., 2008) е зголемен со притисок (Нишида и сор., 2008). Покрај срцето на глувчето, панексин-1 може да се открие и во сарколемата на кардиомиоцити на кучиња (Долматова и сор., 2012). 15-ти
Вовед Покрај преодните и огноотпорни периоди, сегашната работа исто така има за цел да ги анализира ранливостите на глувците TASK-1 +/+ и TASK-1 -/- in vivo со помош на програмирани октаполарни катетри во електрофизиолошка студија (ЕПУ), може да се утврди интракардијална стимулација. 25-ти
Материјал и методи 2 Материјал и методи 2.1 Генотипизација на глувци Панексин-1 и ТАСК-1 ВТ и КО 2.1.1 Подготовка на ДНК од врвови на опашката Подготовката на ДНК со помош на ДНези комплет за крв и ткива (Киаген, Хилден) беше извршена од приближно Без коскени врвови на опашката долги 3 мм, кои беа извадени од глувците кога беа одвикнати во исто време со обележувањето на увото. Примерок од ткиво Растворање на клеточните wallsидови Врзување на процесот на миење на ДНК Слика 2.1: Принцип на подготовка на ДНК модифициран според упатството на ДНези комплет за крв и ткиво Во текот на првиот чекор, протеиназата К ги раствора клеточните wallsидови и со тоа ја ослободува нивната ДНК. Различни пуфери тогаш овозможуваат оптимално врзување на ДНК со мембраната DNEasy на специјално доставените цевки. Два процеси на перење на крајот доведуваат до отстранување на неупотребливиот материјал и ензимските инхибитори и чистата ДНК што треба да се исчисти подготвена за употреба. Чистотата на ДНК за спречување и концентрацијата на ДНК за елукција се утврдени фотометриски (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, САД). 26-ти
Материјал и методи видлив пакет на Неговата возбуда. Како по правило, најјасно се гледаше во снимките во кои амплитудата на атријалната возбуда беше скоро иста како онаа на комората. Неговото возбудување на пакетот Атриум (А) А Неговиот почеток: атриум сигнал V Почеток: вентрикуларна стимулација (V) Слика 2.6: Неговото мерење на пакетот во панексин 1 +/+ глушец. Сенсирање (снимање на сигнал) со e3e4 Пакетот на Неговиот може да се препознае најдобро кога амплитудите на атријалната и вентрикуларната возбуда беа слично високи за време на интракардијалното снимање. Ако се најде пакет од неговата возбуда, беа забележани шест последователни отчукувања на срцето за секој глушец во однос на АХ (почеток на атријална стимулација до пакетот Негов), ХВ (пакет од Неговиот почеток на вентрикуларна стимулација) и АВ-интервал (почеток на атријална до Почеток на побудување на комората). Ова го извршивме на шест глувци панексин-1 и пет ТАСК-1 од двата генотипа. Просечните вредности по животно се проценувани статистички. 38
Материјал и методи 2.8 Телеметриски прегледи на панексин-1 +/+ и панексин-1 -/- глувци 2.8.1 Основи Во глувците, долгорочните ЕКГ можат да се снимаат само со помош на предаватели поставени поткожно или интраперитонеално. Тие се добар начин да се постигне срцевиот ритам што се одржува во мирување без проблеми со наркотични средства (Бернштајн, 2003; Берул 2003). EKG сигналите се снимаат од две електроди, се пренесуваат до плочите на приемникот, се филтрираат со матрица (и DSI Data Science, Минеаполис, САД) и конечно се прават видливи од компјутерската програма (LabChart 7). Слика 2.8: Наши предаватели за телеметрија Предавателите имплантирани поткожно од нас (модел ETA-F10 од DSI). 1 машки и женски панексин-1 WT и нокаут глувци на возраст од 3-6 месеци и со тежина од најмалку 23 g се користени за поткожна имплантација на приближно 1,6 g тежок предавател (DSI Data Science, Минеаполис, САД) користени Како и обично со глодарите, сите животни имаа слободен пристап до храна и вода се додека не се предизвика анестезија. 1 http://www.datasci.com/products/implantable-telemetry/mouse-(miniature)/eta-f10 43
Материјал и методи 2.8.2 Подготовки за имплантација на предавател Штом животните достигнале фаза на толеранција на анестезија по интраперитонеална инјекција на кетамин и ксилазин, ги поставивме во лежечка положба на плоча за затоплување (HAT 007, Minitüb GmbH, Tiefenbach). Вашите екстремитети беа прицврстени за вторите со лепливи ленти, додека ние ги третиравме очите со комерцијално достапни масти за очи (на пр. HYLO -Gel, Ursapharm, Saarbrücken) за да се заштитиме од дехидрација. Тестните животни беа снабдени со 0,5 л/мин кислород (Linde AG, Pullach) и 1,5 вол% изофлуран (Isoflurane Actavis, Actavis, Минхен) преку маска за гас од латекс. Тие биле на апарат за вшмукување од плексиглас, специјално направен за оваа намена и кој требало да спречи излегување на воздух што содржи изофлуран. Слика 2.9: Глушец на операционата маса Глушец на уредот за вшмукување плексиглас и подлогата за греење. Синото парче латекс служеше како гасна маска. За време на овие препарати, стерилниот предавател и мешан шприц од 1 ml направен од 5% гликоза и физиолошки солен раствор се загреаа во водена бања. 44
Материјал и методи На крајот на истрагите, глувците биле убиени, предавателите на телеметријата биле отстранети и исчистени и дезинфицирани со помош на растворите на Гигазим и Гигасепт (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt). 2.8.5 Снимање на долгорочните ЕКГ аналогни на Крамер и сор. (1998) започнавме со снимање на 24-часовните ЕКГ десет дена по имплантацијата на предавателот. За да не предизвикаат иритација или промени во однесувањето, животните останале во индивидуални кафези за време на снимањето. Во деновите на снимањето на EKG, се внимаваше да се избегне невообичаена изложеност на луѓе и звуци во просторијата на животните, така што обратниот ден-ноќен ритам не беше нарушен. Сите уреди потребни за снимање на ЕКГ, како лабораторија за напојување, компјутер, монитор, плочи за снимање, кутија и разни кабли за напојување, беа темелно дезинфицирани пред да бидат донесени во соодветната просторија за животни (Incidin Liquid, Ecolab, Monheim). Податоците се снимени со софтверот LabChart 7 (ADInstruments, Spechbach) и стапка на земање примероци од 1 kHz. Компјутер со софтвер за анализа Приемник-влезен-матричен приемник на предавателот Слика 2.11: Шематски приказ на долгорочното снимање на ЕКГ изменето од Крамер, 2000 47
Материјал и методи 2.8.7.1 Експериментите за пливање пливање (СВ) се сметаат во експерименталната медицина на животни како движење со постојан напор, што доведува до субмаксимален напор (Бернштајн и сор., 2003). По телеметрично снимање на ЕКГ во мирување во текот на пет минути, животните пливаа индивидуално уште пет минути во кафез Макролон со големина II (висок 15 см исполнет со топла вода од чешма од 37-39 Ц). Ако индивидуалните животни беа потопени поради исцрпеност, тие беа кратко поддржани рачно. ЕКГ беше снимен за време на пливање и за време на 10-те минути по вежбањето, глувците се вратија во своите кафези. Слика 2.12: Глушец додека пливате со рачна поддршка За проценка, го поделивме обидот за пливање во три фази како што следува: Табела 1: Време на обидот за пливање Времетраење на фазата (мин) Активност 1 0 до 5 Одмор 2 5 до 10 Пливање 3 10 до 20 Обнова 2.8.7.2 Вежба за неблагодарна работа Вежба Постигнување на физички напор со работа на неблагодарна работа се смета за златен стандард со цел да се одржи контролираниот кардиоваскуларен стрес кај луѓето или другите големи цицачи 49
Материјал и методи Одржувајте ја брзината на одење со или без наклон и завршете кога животните ќе се исцрпат (Десаи и сор., 1999; Кеми и сор., 2002; Масет и Берк, 2005; Нибауер и сор., 1999). Нашиот прв нервозен протокол I без наклон (види Таб. 2) беше ограничен на прав пат за трчање, при што брзината постојано се зголемуваше се до појавата на замор. Табела 2: Протокол на лента за трчање I без време на наклон (мин) Вториот протокол на неблагодарна работа II со наклон беше спроведен најрано 2 дена по првиот со цел да им се овозможи на животните време на регенерација. Во прилог на постојан пораст на брзината, се воведуваа наклони во 5 чекори од 0 до 25 на секои четири минути (види Табела 3). Брзина (m/min) Време (min) Брзина (m/min) 0 2 20 13 2 3 22 14 4 5 24 15 6 6 26 16 8 7 28 17 10 8 30 18 12 9 32 19 14 10 34 20 16 11 36 21 18 12 38 22 Табела 3: Протокол на лента за трчање II со наклон Време (мин) Брзина (м/мин) Поставување на рампата (степени) Време (мин) Брзина (м/мин) Поставување на рампата (степени) 0 2 0 16 10,2 20 2 3 "18 11,4" 4 3,3 5 20 12,5 25 6 4,5 "22 13,7" 8 5,6 10 24 14,8 "10 6,8" 26 15,9 "12 7, 9 15 28 16,5 "14 9,1" 30 17,7 "51
МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ Веднаш по почетокот на исцрпеноста, животните беа вратени во своите кафези и нивниот ЕКГ беше снимен во 10-минутната фаза на опоравување. Поминато растојание и брзина во моментот на замор биле забележани за секој глушец. Фазата на опоравување секогаш се одвиваше под опсервација и беа забележани какви било абнормалности. Слика 2.14: Глушец на права лента за трчање Ако и протоколите на неблагодарна работа и поврзаните фази на закрепнување завршија, животните беа убиени со дислокација на грлото на матката. Потоа се користеа за одредување на параметрите на телото. Како и кај тестот за пливање, тестовите за лента за трчање беа поделени во три различни делови за евалуација: Табела 4: Време на тестирање на двата лента за траење Фаза Времетраење (мин) Активност 1 0 до 5 Одмор 2 5 до 10 Неблагодарна работа 3 10 до 20 Обнова 52
Материјал и методи Благодарение на високата стапка на рамки и добрата просторна резолуција, ехокардиографските прегледи на малото срце на глувчето со високиот ритам на срцето сега се исто така можни. Ехокардиографијата е извршена со Vevo 2100 (FUJIFILM Visual Sonics Inc., Торонто, Канада) и линеарен трансдуцер MS 400 со 18-38 MHz. 10 отчукувања на срцето беа просечни по измерена вредност кај 14 глувци со недостаток на панексин-1 +/+ - и 12 панексин-1. Слика 2.15: Ултразвучен уред што го користевме 2 Сите глувци беа испитани со ехокардиографија не порано од дванаесет дена по имплантацијата на предавателот. 2.9.2 Изведување на ехокардиографија Индукцијата на анестезија е извршена со 5% изофлуран (Isoflurane Actavis, Actavis, Минхен) и 0,5 l/min кислород (Linde AG, Pullach) и е намален на 1,5% изофлуран со проток на кислород што останува константен Да се задржи влијанието на анестетичкиот гас врз кардиоваскуларниот систем што е можно пониско. Theивотните треба да бидат само неподвижни. За истрагата, глувците биле ставени на грб на загреаната плоча на системот Вево, која била претходно загреана на температурата на телото, што служело и како подвижна маса, 2 www.visualsonics.com/vevo2100 54
Поставени материјали и методи. За таа цел, нејзините шепи беа фиксирани со леплива лента на сензорите за снимање на EKG, главата беше ставена во маската за гас и се следеше температурата на телото со помош на ректален сензор. Со цел да ги задржиме ултразвучните слики што е можно повеќе артефакти, ги избричивме глувците во пределот на градите (Контура, Вела, Дармштад). Слика 2.16: Глушец за време на ехокардиографија Тестното животно лежи на масата за затоплување за време на ехокардиографијата и прима анестетички гасови (изофлуран) преку маска. Заради наб monitoringудување, неговите екстремитети се прицврстени на ЕКГ сензори со лепливи ленти и ректален сензор (сина) ја бележи температурата на телото. За подобар преглед, ја одбравме парастерналната долга оска како прва слика. Во оваа поставка, беа забележани протокот на аортата, дијаметарот на прстенот на аортната валвула, должината на срцето и режимот М за мерење на дебелината на wallидот. 55
Материјал и методи Слика 2.17: Мерење на дијастолната должина на срцето и внатрешниот обем на срцето во парастерналната долга оска Зелена: Рачно кружење на ендокардот и мерење на должината на срцето во дијастолата Покрај тоа, ја искористивме оваа поставка за да ја пресметаме левата комора на срцевата маса според методот на должина на површина, што доведува до најдобри резултати кај луѓето и глувците (Collins et al., 2001; Devereux et al., 1986). Должината на левата комора се мери од ендокардијалниот врв до митралниот анулус и се произведува М-режим на ниво на папиларен мускул (Колинс и сор., 2001). Со следното второ поставување, кратката оска, зачувавме 3 различни рамнини за сечење во режим Б во областите на врвот, центарот и основата. За таа цел, ендокардот беше рачно заокружен во сите три рамнини за сечење во систола и дијастола. Слика 2.18: Кратка оска во режим Б (лева комора) Црна во средината = срцев лумен, околу него светло сива = ендокардија, темно сива = миокард 56 десна комора
Материјал и методи 2.11 Статистички проценки Податоците за сите експерименти се претставени како средни вредности (MW) ± стандардна девијација (SD) и доаѓаат од бројни глувци (n) објаснети во секој експеримент. Во зависност од тоа што е соодветно за прашањето, статистичкото значење беше пресметано со непарниот t-тест, еднонасочната ANOVA или линеарната регресија. Со p-вредност од