ТЕХНИЧКИ УНИВЕРЗИТЕТ МУНИЧКИ - PDF Бесплатно преземање

Клиника и поликлиника за трауматска хирургија на клиниката ТЕХНИШЕ МЕНЧЕН Нокаут глушецот MDR 2 како модел на хепатална остеодистрофија Андреа Шмид Комплетна копија на дисертацијата одобрена од Медицинскиот факултет на Техничкиот универзитет во Минхен за да се добие академски степен доктор на медицина Претседавач: Унив.-Проф. Д-р E. J. Rummeny Испитувач на дисертацијата: 1. апл.проф.д-р. A. K. Nüssler, Универзитетот Еберхард-Карлс во Тибинген 2. Унив.-Проф. Д-р Р. фон Ајзенхарт-Роте Дисертацијата е доставена до Техничкиот универзитет во Минхен на 31 јули 2012 година и е прифатена од Медицинскиот факултет на 13 ноември 2013 година.

Содржина Содржина Список на кратенки 1 Вовед 1 1.1 Општ вовед 1 1.2 Црн дроб 1 1.2.1 Хистолошка структура на црниот дроб 1 1.2.2 Физиолошки функции на црниот дроб 2 1.2.3 Патофизиологија на црниот дроб 3 1.3 Коски 4 1.3.1 Коскена структура, коскена структура и клетки 4 1.3.2 Ремоделирање и физиолошки задачи на коските 5 1.3.3 Нерамнотежа на метаболизмот во коските 6 1.4 Ситуација на студијата 7 1.4.1 Промени во коските кај хронични заболувања на црниот дроб 7 1.4.2 Реверзибилност на хепатална остеодистрофија 8 1.5 Метаболизам на витамин Д 10 1.6 Улогата на TGF-β во црниот дроб и метаболизам на коските 11 1.7 Алтернативен животински модел 13 1.8 Истражувачко прашање 14 2 Материјал и методи 15 2.1 Дизајн на студијата 15 2.2 Тест-животни 16 2.2.1 Видови на глувци 16 2.2.2 Подготовка на препаратот 17

Содржина 2.2.2.1 Материјал 17 2.2.2.2 Метод 17 2.3 Хистологија 18 2.3.1 Хистотехнологија 18 2.3.1.1 Фиксација на примероци од ткиво на црн дроб 18 2.3.1.1.1 Материјал 18 2.3.1.1.2 Принцип 18 2.3.1.1.3 Извршување на фиксација на ткиво 18 2.3 .1.2 Дехидратација и вградување на примероци од ткиво на црн дроб 18 2.3.1.2.1 Материјал и опрема 18 2.3.1.2.2 Принцип на дехидратација и вградување 19 2.3.1.2.3 Спроведување на дехидрираност и вградување 19 2.3.1.3 Производство на парафински делови 19 2.3. 1.3.1 Материјал и опрема 19 2.3.1.3.2 Принцип на подготовка на делови 20 2.3.1.3.3 Постапка 20 2.3.1.4 Боење и монтирање на хематоксилин-еозин 20 2.3.1.4.1 Материјал 20 2.3.1.4.2 Принцип на хематоксилин Боење со еозин 21 2.3.1.4.3 Спроведување на боење 21 2.3.1.5 Боење и монтирање на трихром на Масон-Голднер 23 2.3.1.5.1 Материјал и опрема 23 2.3.1.5.2 Принцип на боење на трихром на Масон-Голднер 24 2.3. 1.5.3 Спроведување на боење 24 2.3.2 Лесна микроскопска проценка на делови на црниот дроб Подготовки 27 2.3.2.1 Уреди и софтвер 27 2.3.2.2 Принцип на микроскопска евалуација на светлината 27

Содржина 2.3.2.3 Спроведување на микроскопска евалуација на светлината 27 2.4 Определување и проценка на вредностите на крвниот серум 28 2.4.1 Определување на активноста на ензимот 28 2.4.1.1 Материјал, опрема и софтвер 28 2.4.1.2 Принцип на одредување на ензимската активност 29 2.4.1.3 Спроведување на определување на активноста на ензимот 29 2.4.2 TGF-β -Определување на концентрација 31 2.4.2.1 Материјал, уреди и софтвер 31 2.4.2.2 Принцип 32 2.4.2.3 Извршување на определување на концентрацијата на TGF-β 32 2.5 Мерења на микро-КТ 35 2.5.1 Уред и софтвер 35 2.5.2 Принцип на мерење на миксот 35 2.5 .3 Спроведување на мерењето на μct 35 2.5.4 Опишани параметри на коските 36 2.6 Квантификација на генската експресија во црниот дроб и коскеното ткиво 36 2.6.1 изолација на РНК од црниот дроб и коскеното ткиво 36 2.6.1.1 Материјал, опрема и софтвер 36 2.6.1.2 Принцип на РНК Изолација 37 2.6.1.3 Изведување на изолација на РНК 38 2.6.2 Комплементарна синтеза на ДНК (ЦДНА) 40 2.6.2.1 Материјал и опрема 40 2.6.2.2 Принцип на синтеза на ЦДНА 40 2.6.2.3 Извршување g синтеза на ЦДНА 41 2.6.3 ЦДНА засилување со употреба на полимеразна верижна реакција (PCR) и електрофоретичко одвојување на ДНК 41 2.6.3.1 материјал, опрема и софтвер 41

Содржина 2.6.3.2 Принцип на ПЦР и гел-електрофореза 42 2.6.3.3 Спроведување на ПЦР и гел-електрофореза 43 2.6.3.4 Применети прајмери 44 2.6.4 Дензитометриска проценка на генскиот израз 46 2.6.4.1 Софтвер 46 2.6.4.2 Принцип и извршување на густинометриската проценка 46 2.7 Статистички Евалуација 46 2.7.1 Софтвер 46 2.7.2 Изведување на статистичка проценка 46 3 Резултати 47 3.1 Хистолошка проценка на ткивото на црниот дроб со текот на времето 47 3.2 Зголемено ниво на трансаминаза и дехидрогеназа во крвниот серум на глувците MDR2 -/- 51 3.2.1 Ензимска активност LDH 51 3.2. 2 Ензимска активност ASAT 52 3.2.3 Активност на ензимите ALAT 53 3.3 Променета архитектура на коските кај MDR2 -/- глувци 54 3.3.1 Архитектура на кортикални коски 54 3.3.2 Архитектура на карцином на коски 56 3.4 Хронично зголемени нивоа на TGF-β серум кај MDR2 -/- глувци 60 3.5 Намален израз на коскени маркери кај постари MDR2 -/- глувци 61 3.5.1 Израз на OPN во ткиво на црн дроб 62 3.5.2 Израз на остеокалцин во ткиво на црн дроб 63 3.5.3 изразување на OPG во ткиво на црн дроб 64 3.5.4 изразување на OPN во коскено ткиво 65 3.5.5 експресија на остеокалцин во коскеното ткиво 66

Содржина 3.6 Генска експресија на црнодробно ткиво на ензими и протеини кои го регулираат метаболизмот на витамин Д 67 4 Дискусија 69 4.1 Ограничување и перспектива 77 5 Резиме 80 6 Список на слики 82 7 Список на табели 83 8 Библиографија 84 9 Додаток 94 9.1 Оптимизација на боење 94 9.1.1 Боење на ХЕ 94 9.1.2 MGT Боење 95 9.2 Дополнителни хистолошки слики 96 9.3 Дополнителни информации за употребените буквари 98 9.3.1 β-актин 98 9.3.2 Остеокалцин 100 9.3.3 Остеопонтин 105 9.3.4 Остеопротегерин 107 9.3.5 MDR2 111 10 Благодарници 117

Список на кратенки 25 (OH) D 3 25-хидроксихолекалциферол 1,25 (OH) 2 D 3 1α, 25-дихидроксихолекалциферол PBC PBS PCR ph PSC PTH RANKL RNA RT RT-PCR сек SMI Taq TBE Tb.N Tb.Sp Tb.Th TGF -β TRAP TV ao UV V VDBP на пр. примарна билијарна цироза фосфат-пуфер солен раствор полимеразна верижна реакција pondus hydrogenii примарен склерозирачки холангитис активатор на рецептор на паратироиден хормон за нуклеарен фактор κ В лига рибонуклеинска киселина собна температура обратна транскриптаза полимераза верижна реакција втор индекс на структурен модел Индекс на структура модел термофилус акватикус Трис-борат вклучувајќи ги и ултравиолетовите волти протеини кои врзуваат витамин Д на пример

1 Вовед 13 Сл. 1-5 Хипотетички регулаторен механизам на хепатална остеодистрофија TGF-β како можен регулатор Графички извори: http://www.servier.de/medicalart/skelett-und-knochen/?catselect=5; http://www.servier.de/medicalart/ arterien-Physiologische /? catselect = 0; http://www.servier.de/medicalart/verdauungssystem/?catselect=7; 5 август 2011 година 1.7 Алтернативен модел на животни Во целина, не постојат долгорочни студии in vivo кои се извршени прецизно и се доволно обемни. Во таков случај, популацијата на пациентот (тип, времетраење, фаза на заболување на црниот дроб; возраст, пол, истовремени заболувања

2 Материјал и методи 22 1. Дексимирање на Ротикелар I 3 мин Ротикелар II Ротикелар III 2 мин 2 мин Ротикелар IV 2 мин Ротикелар V 2 мин 2. Рехидратација 99,9% EtOH I 3 мин 99,9% EtOH II 3 мин 99,9 % EtOH III 2 мин. 90% EtOH 2 мин. 80% EtOH 2 мин. Т.е. 2 O 2 мин. 3-то боење на раствор на хемалум кисел според Мајер 5 мин проточна вода од чешма 15 мин еозин G раствор 0,5% воден 3 min т.е. 2 О накратко 4. Дехидратација 80% EtOH 30 сек. 90% EtOH I 4 мин. 90% EtOH II 4 мин. 99,9% EtOH I 3 мин. 99,9% EtOH II 5 мин 5. Исчистете го Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 мин 5 мин 5 мин 3 мин Табела 2-2 Протокол за боење со хематоксилин-еозин: секунда Резултатите од боењето се јадра со сино-виолетова клетка, бледо црвена цитоплазма, црвени мускулни влакна, црвено-портокалови еритроцити и црвено колагенско сврзно ткиво (види слика 2-1) ).

2 Материјал и методи 23 Сл. 2-1 Пример за хематоксилин еозин боење на црниот дроб, женски MDR2 -/- глушец, недела од животот 5 2.3.1.5 Боење и покривање на трихром со масон-Голднер 2.3.1.5.1 Материјал и опрема Ротипуран 100% оцетна киселина без РОТ (Бр. Бр.: 3738.4) EtOH 99,9%, 90%, 80%, 70% раствор на хематоксилин А според растворот на Вајгерт на хематоксилин Б според Weigert Apotheke des MRI ROTH (број на мачка: X906.1) РОТ (мачка-бр.): X907.1) Светло зелена SF жолтеникава MERCK (број-мачка: 115941) портокал G MERCK (број-мачка: 115925) Понкау ксилидин FLUKA Chemie GmbH (број на мачка: 81465) Кисела фуксин FLUKA Chemie GmbH (број-мачка).: 84600) хидрат волфрофосфорна киселина кристално најчист МЕРК (број-мачка: 100582) Ротикелар РОТ (Бр. Бр. А538) Опсег на магнетни стапчиња Магнетски мешач МР Хеи-Микс Л Аналитичка рамнотежа РОТ (Бр. Кат: C267.1) Хајдолф инструменти, Д-Швабах Керн и Сон ГмбХ, Д-Балинген

2 Материјал и методи 25 3. Киселина фуксин понсо ксилидини 0,2 грама (g) Понсо ксилидини 0,1 g киселина фуксин 300 ml ddh 2 O 0,6 ml 1% оцетна киселина 4. Фосфотонгична киселина портокал G 12 g волфрофосфорна киселина 3 g портокал G 200 ml ddh 2 O 5. светло зелена 0,3 g светло зелена SF жолтеникава 200 ml ddh 2 O 0,4 ml 1% оцетна киселина Споменатото боење е извршено според протокол развиен преку оптимизација на боја (види Поглавје 9.1 подолу) (види Табела 2-3) . Обоените, дехидрираните и исчистените делови потоа беа покриени со Роти-Хистокитт II на ист начин како и деловите со ОБИЛ. Мешавината на хематоксилин А и Б според Вајгерт може да се чува најмногу 8 дена на собна температура. Резултатите од боењето се црно-кафеави клеточни јадра, црвена цитоплазма, светло-црвени мускулни влакна, портокало-црвени еритроцити и зелено колагенско сврзно ткиво (види Слика 2-2). Сл. 2-2 Пример за црн дроб на боење со трихром Masson-Goldner, женски MDR2 -/- глушец, возраст од 44 недела

2 Материјал и методи 26 1. Дексимирање на Ротикелар I 3 мин Ротикелар II Ротикелар III 2 мин 2 мин Ротикелар IV 2 мин Ротикелар V 2 мин 2. Рехидратација 99,9% EtOH I 3 мин 99,9% EtOH II 3 мин 99,9 % EtOH III 2 мин. 90% EtOH 2 мин. 80% EtOH 2 мин. 3-то боење на хематоксилин според Вајгерт 4 мин проточна вода од чешма 10 мин киселина фуксин-понсо-ксилидини 2-4 мин 1% оцетна киселина кратка фосфотонгистична киселина портокал G 5 мин 1% кратка оцетна киселина Светло зелена 15 мин 1% оцетна киселина 2 мин 4. Дехидратација 80% EtOH 30 сек 90% EtOH I 4 мин 90% EtOH II 4 мин 99,9% EtOH I 3 мин 99,9% EtOH II 5 мин 5. Исчистете го Roticlear I 3 мин Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 мин. 5 мин. 5 мин. 3 мин. Табела 2-3 Боење на трихром на протокол Масон-Голднер

2 материјали и методи 28 Хематоксилин-еозин Масон-Голднер три. Фаза I плус 0 LRMCLRMC перидуктални депозити на сврзното ткиво 1-3 едем 1 портален воспалителен инфилтрат 1 фаза II плус 5 пролиферација на жолчните канали 1 перипортална инфламаторна инфилтрат 1 портално-перипортална фиброза 1-5 некроза изедена од молци 1 фаза III плус 13 атрофија на жолчните канали 1 некроза на пекторалниот кортекс 1 -3 IV плус 18 ретки фракции на жолчните канали 1 билијарна цироза 1 резултат Табела 2-4 Резултат за хистолошка проценка 2.4 Определување и проценка на вредностите на крвниот серум 2.4.1 Определување на ензимската активност 2.4.1.1 Материјал, уреди и софтвер Fluitest комплет за испитување LDH-L ANALYTICON Biotechnologies (Бр. Број: 2222 ) Fluitest GOT/ASAT ANALYTICON биотехнологии (број на мачка: 1176) Fluitest GPT/ALAT ANALYTICON биотехнологии (број на мачки: 1186) LDH-Standard 0: NobiCalserum Multi Nobis/HITADO

de/min 2 Материјал и методи 31 промена на апсорпцијата формирана на мин. Овие средни вредности беа нацртани во дијаграм на точки на ординатата наспроти познатите ензимски активности по стандард на апсцисата. Потоа се пресмета линеарна регресивна линија на дијаграм на точки, како и функцијата што ја опишува и нејзиниот коефициент на определување. Измерената вредност за стандардот 8 одговараше на празната вредност. Пресметаната функција беше достапна во следнава форма: По решавањето на формулата за x, се користеше периодот од 0 мин до х мин од секој примерок во серумот за y. Х-вредностите утврдени на овој начин одговараат на ензимската активност на серумскиот примерок коригирана за празната вредност и беа пренесени во табелите на Microsoft Excel, статистички евалуирани со помош на GraphPad Prism и прикажани се графички. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1,05 0-0,05 Стандардна крива LDH y = 0,0027x - 0,0213 R² = 0,9987 0 20 40 60 80 100 120 140 Ензимска активност [U/l] Сл. 2-3 Стандардна крива пример LDH фотометриска проценка на LDH стандардните решенија вклучувајќи ги стандардите 3-7 2.4.2 Определување на концентрацијата на TGF-β 2.4.2.1 Материјал, опрема и софтвер Рекомбинантен хуман TGF-β 1 пепротех ( Бр. Мачка: 100-21) Дулбеко PBS (1) PAA Laboratories GmbH (бр. Мачка: H15-002)

de/min 2 Материјал и методи 34 Доделувањето на зголемувањето на истребувањето во минута на одредена концентрација на TGF-β е направено со помош на стандардна крива (види Слика 2-4). За оваа цел, средните вредности на стандардот наспроти познатите концентрации на TGF-β 1 по стандард беа нацртани на апсцисата во дијаграм на точка на ординатата. Беа пресметани линеарната регресивна линија на точката дијаграм, како и функцијата што ја опишува и нејзиниот коефициент на определување, при што вредноста измерена за стандардот 8 одговара на празната вредност. Пресметаната функција беше достапна во следнава форма: Стандардна крива TGF-β 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,0033x + 0,0325 R² = 0,9803 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Концентрација [ng/ml] Сл. 2-4 TGF-β стандардна крива фотометриска проценка на TGF-β стандардните решенија По решавањето на формулата за x, временскиот период 0 мин. користени до x мин од секој примерок од серум. Х-вредностите утврдени на овој начин одговараат на концентрациите на TGF-β во серумскиот примерок корегирани за празната вредност и беа пренесени во табелите на Microsoft Excel, статистички оценети со помош на GraphPad Prism и прикажани се графички.

2 материјали и методи Бр.: X901.1) Так полимераза 1.000 У Axon Labortechnik (Бр. Број: 22466) Тафе-полимераза тампон за реакција 10 БД MgCL 2 dntp-мешавина 10 мм по нуклеотид ) aminomethane Mastercycler ep gradient PowerPac TM HC Power Supply Gel ix Imager SIGMA (Cat-No.: T87602-3KG) Eppendorf AG, D-Hamburg Bio-Rad Laboratories GmbH, D-Munich Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen Intas Steuer Софтвер за аквизиција на слики Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen 2.6.3.2 Принцип на PCR и електрофореза на гел PCR е метод за да може селективно да се засилат одредени делови на ДНК in vitro. За таа цел, цевките исполнети со ЦДНА и реакционата мешавина поминуваат низ 40 циклуси во уредот како што е градиентот на Mastercycler. Секој циклус се состои од 3 чекори: 1. Денатурација на 95 C, постојните водородни врски помеѓу ДНК насоките или прајмерите се скршени така што ќе останат само единечни жици. За време на иницијализацијата, овој чекор се продолжува за 5 минути за да се одделат што е можно повеќе жици.