Универзитет Хамбург - Епендорф - PDF бесплатно преземање
Универзитетски медицински центар Хамбург - Епендорф центар за експериментална медицина Институт за биологија на молекуларна клетка Директор: проф. рер. Физиол. Д-р Х. в Улрике Бејсигел За механизмот на хепатомегалија кај болести на преоптоварување железо. Истражување на генската експресија кај модел на животно од стаорец Дисертација за добивање на диплома ДОКТОР МЕДИЦИНАЕ на медицински факултет на Универзитетот во Хамбург Хамбург - Епендорф презентирана од: Ехсан Ка Khalани роден во Техеран/Иран Хамбург 2010
Прифатено од медицинскиот факултет на: 25.10.2010 година Објавено со одобрение од медицинскиот факултет на Универзитетот во Хамбург Научен надзор: ПД Др. Д-р Одбор за ревизија на Питер Нилсен, претседател: проф. Д-р Испитен одбор Улриеке Бајсигел: 2-ри рецензент: ПД Др. Д-р Испитен одбор на Питер Нилсен: 3-ти рецензент: проф. Д-р. R. Böger - 1 -
Содржина 1. Вовед Метаболизам на железо 5 Медицинско значење на железо 12 Црн дроб: функција и физиологија 16 Зголемување на црниот дроб 17 Опис на животинскиот модел и значење на масната група и методи) Сонографско испитување на волуменот на црниот дроб 28 Ин виво определување на концентрацијата на железо во црниот дроб со SQUID 29 Статистичка проценка на податоците за пациентот 30 Стаорец животно модел со ТМХ замрзнат 32 Отстранување на црниот дроб 33 Определување на концентрација на железо во црниот дроб на стаорец in vitro 34 Хистолошка обработка на црниот дроб на стаорец 35 Изолација на ДНК, протеините и РНК за РТ RTT PCR 36 РНК електрофореза гел 38 Транскрипција на RNA во cdna 40 Генерирање и подредување на прајмерите 41 Спроведување на RT RT PCR 44 Статистичка анализа на РТ РТ РЦР податоци 45 ДНК гел електрофореза 49 Спроведување на Western blots со p-акт 5 0-3 -
3. Резултати Статистичка евалуација на податоците за пациентот 51 Обем на црниот дроб на стаорец 53 Определување на концентрација на железо во црниот дроб на стаорец in vitro 54 Хистолошка обработка на црн дроб на стаорец 55 Тежини на црн дроб на стаорец 56 Евалуација на РТ РТ РЦР и резултати од Western blots 57 ДЕК гел електрофореза 68 4. Дискусија Дискусија за податоците на пациентот 69 Дискусија за Хистологија 70 Дискусија за податоците од RT rt PCR и Western blots 71 Заклучок 77 5. Резиме 80 6. Список на кратенки 82 7. Извори и референци 83 8. Додаток (додатоци) RT RT PCR крива 88 ДНК гел електрофореза 88 Општа датотека за хранење 92 9. Благодарност 93 10. CV 94 11. Доверба 96-4 -
Сл.2 Ironелезото влегува во телото на два начина. Или преку HCP1 во хем форма или како намалено растително железо преку DMT1. Со помош на хем оксигеназа, железото се ослободува од хем. Според Донован и сор. (Физиологија 21: 115-123.2006) Овде тој се претвора во својата тривалентна форма од страна на Хефестин, ферооксидаза што содржи бакар, со цел да се промени неговата растворливост и, конечно, трансферин, донесен до својата дестинација (11). Сл.3: Позиција на Хефестин на базолатералниот wallид на ентероцитите. Ова е местото каде што железото се претвора во својата тривалентна форма и се врзува за трансферин. Мутација на феропортин во автосомно доминантна хемохроматоза: губење на функцијата, разбирање, Флеминг и сор. (2001) - 7 -
Истото важи и за рецепторот на трансферин. Сл.6 Регулаторните протеини на железото се врзуваат за 3 - крајот на трансферинскиот рецептор mRNA со карактеристичната структура на стеблото-јамка и на тој начин обезбедуваат намалено распаѓање на мрна (мала деградација). Според Санчез и сор. (2006) Преку овој механизам, железото се инкорпорира во групата железо-сулфур на IRP1 (IRP1 се одвојува од IRE), така што навлегувањето на железо се намалува како резултат на намалената експресија на DMT1 и циклусот опишан погоре може да започне повторно . Прикажаната регулатива може, сепак, да се одвива и на 5-те непреведувани краја на мрната, каде што може да се забележи спротивниот ефект, т.е. ограничување во преводот (21,22). Сл.7 IRP се врзуваат за 5-от крај на феритинската mRNA и така спречуваат превод на mna. Според Санчез и сор. (2006) - 10 -
Во меѓувреме, познати се многу гени кои носат мотиви IRE, кои дури можат успешно да се идентификуваат биокомпјуционално, без низи. Биокомпјументална значи дека мотивите се снимаат со посебен софтвер за компјутерско пребарување заснован на познатите редослед на мрна во PubMed. Сл. 8 Претставување на гените кои носат IRE кои се идентификувани како биокомпусионални. Регулирање на железо и клеточен циклус, М Санчез и сор., Ј Биол хем. 2006 август 11; 281 (32): 22865-74. Epub 2006 7 јуни Откако апсорбираното железо е транспортирано во целната клетка со трансферин, железото се складира во феритинот како полимерен железен оксид-хидроксид-фосфат. Сл.9 Оваа слика на феритин произведена од Х-зрачна кристалографија покажува складирање на минералното железо во центарот на јадрото на феритин (кафеава). Според Казиди и сор. 2004 Феритин е во состојба да ослободува железо од продавниците или да продолжи да чува железо, во зависност од потребите на организмот. - 11 -
Сл.11: Принцип на липидна пероксидација и нејзините последици Според Нилсен и сор. (2006), многу други клинички слики се поврзани со преоптоварување на железо, иако сериозноста на симптомите зависи од соодветната генетска варијација. Миокардиоцитите складираат железо, што доведува до токсична миокардна фиброза. Во панкреасот, хемохроматозата може да доведе до фиброза на панкреасот со плуригландуларна инсуфициенција, што може да резултира со секундарен дијабетес мелитус. Ова се нарекува и бронзен дијабетес поради постојната преголема пигментација на кожата. Сидероза на плазма клетки, која се карактеризира со грубо интрализозомно таложење на железо во близина на јадрото, често може да се дијагностицира во коскената срцевина (28). Депозитите на железо се забележуваат во сите случаи според класичната пруска сина боја. Болеста комплексна хемохроматоза е поделена на четири подформа. Симптомите и сериозноста се различни. Хемохроматоза тип 1 е најчестиот подтип во западниот свет (29) и исто така е предмет на студии на пациенти во оваа докторска теза. - 14 -
Liverелезо од црн дроб (mg/g тежина на црн дроб) 35 30 25 20 15 10 5 0 Концентрација на црн дроб во железо со ТМХ-замрзнато хранење H мохроматоза 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 време на хранење во недели Сл. 14 На сликата е прикажан тек на складирање на железо во црниот дроб во mg/g тежина на црниот дроб во однос на времетраењето на хранењето. Со зголемување на времето на хранење, се постигнува плато во количина на железо во црниот дроб. Нилсен 2006 година 1.7. Хистологија Претходните истражувања сè уште не биле во можност да разјаснат дали црниот дроб зголемен со преоптоварување на железо кај стаорци биле хипертрофирани или биле зголемени во обемот поради пролиферацијата. Ниту воспалението сè уште не е исклучено. 1.8. Промени во генската експресија во моделот на животно стаорец Врз основа на претпоставката дека преоптоварувањето со железо и маснотии ќе доведе до варијации во изразувањето на генот, беше испитана транскрипцијата на репрезентативни маркери за предметните метаболички патишта (Слика 15), за што подетално ќе се дискутира подолу. Сл.15 Црниот дроб во центарот на различните метаболички процеси - 20 -
Сл. 17 IGF-1 како дел од оската на црниот дроб-коска на хипоталамо хипофизата. ИГФ-1 е под директно влијание на хормонот за раст и е медијатор на хипертрофија. Извор: http://www.mfi.ku.dk Носачите протеини (IGF-BP 1-6 = Инсулин како фактор на раст - врзувачки протеин) се врзани за плазмата откако ќе се лачи IGF-1 и исто така се под хормон за раст и контрола на инсулин. Овие хормони одредуваат кога IGF1 може да се отцепи од врзувачките протеини, да премине во активна форма и конечно да се поврзе со неговиот рецептор (IGF-R = рецептор на факторот на раст сличен на инсулин). Со својата тетрамерна структура и интрацелуларната тирозин киназа активност, IGF-R наликува на инсулин рецептор и му овозможува на IGF-1 да започне интрацелуларни каскади на сигналот. Резултатот од редоследот на сигналот е тогаш зголемена биосинтеза на протеините, инхибиција на протеолизата, инкорпорирање на тимидини во ДНК и вградување на сулфати во протеогликаните (24). Влијанието на маркерите за хипертрофија беше исто така следено на ниво на протеини. Фосфорилацијата на АКТ-1 се разгледуваше со западни размачки. - 24 -
Сл. 18 IGF-1 и сигналната патека AKT се директно поврзани во анти-апоптотичните патеки. Извор: www.biocarta.com, модифициран од Каaniани 2008 AKT-1 е протеинска киназа за различни патеки на каскадни сигнали (како што се апоптоза, процеси на клеточен циклус, анигиогенеза), но AKT-1 е директно поврзан со IGF-1. Така, АКТ-1 посредува во антиапоптотскиот ефект на ИГФ-1 со зголемување на истиот. Хипертрофија без зголемен AKT-1 може во голема мера да се исклучи бидејќи е исто така централен медијатор во хипертрофичните патеки. Различни фактори кои влијаат на железото врз ACT, сепак мора да бидат земени во предвид, бидејќи железото како штетен агенс интервенира во различни метаболички патишта. Гени на воспаление Прекумерниот раст на клетките може да има други причини освен пролиферација и хипертрофија. Во овој контекст, можно е зголемување на црниот дроб во текот на воспалителниот процес, што сакавме да го забележиме со гледање на маркери за воспаление. Проинфламаторниот маркер класично цитиран во литературата е TNF-a (фактор на некроза на тумор-а), кој затоа го избравме и за нашата студија. - 25 -
1.9. Прашање На следните прашања треба да се одговори во сегашната студија: 1. Дали преоптоварувањето со железо доведува до хепатомегалија кај луѓето, исто како и кај стаорците? 2. Дали евентуалното зголемување на црниот дроб кај пациентите зависи директно од концентрацијата на железо во црниот дроб? 3. Кои гени играат улога во зголемувањето на црниот дроб предизвикано од железо кај стаорци: пролиферација, хипертрофија или воспаление и што покажува хистологијата? 4. Дали преоптоварувањата со железо и маснотии предизвикуваат слични реакции на изразување на гени и ниво на протеини? - 27 -
2. Експерименти (материјал и методи) 2.1. Сонографски преглед на волумен на црн дроб Материјал: - Ултразвучен уред: Picker CS 9500 - Ултразвучен контакт гел: Цезар и Лориц - Вакуумски душек: Vac Fix As - Подвижен кауч За да се утврди волуменот на црниот дроб, пациентите лежат на грб за да може што е можно полесно да се достигне црниот дроб под речниот лак добивка. По ова, направени се ултразвучни слики во сагитталната рамнина со помош на ултразвучната глава под ласерска контрола на растојание од 2 см. Областа на црниот дроб требаше рачно да се обележи на сликите и да се помножи со дебелината на парчето од 2 см. По собирањето на резултатите од 8-те пресечни слики, волуменот на црниот дроб беше приближен. Работата беше спроведена со theубезна поддршка на г-дин Рајнер Енгелхард и Роланд Фишер од клиниката за метаболизам на железо во Центарот за женска и детска медицина, клиника и поликлиника за детска хематологија и онкологија, универзитетска болница Епендорф. Сл. 19 Извадок од досието на пациентот. Забележани се идентификацискиот број (ИД), полот (полот), мутацијата на хемохроматозата (C282Y, H63D), дијагнозата, тежината, висината, како и измерениот волумен на црниот дроб (Вол-лив) и концентрацијата на железо во црниот дроб (ЛИЦ) - 28 -
Првично беше измерена и Gs a (алфа под-единица на стимулирачки G протеин), што покажа споредливи податоци. Сепак, се покажа дека GAPDH е посигурен во практичната работа, така што изразот на целните гени е поврзан со GAPDH. 3.7. Електрофореза на ДНК гел Сликите на ДНК гелови може да се најдат во додатокот. Сликите се користат за проверка на RT PCR за несакани нуспроизводи и контаминација. ДНК гелот може да се користи и за да се утврди дали очекуваниот производ има соодветна големина, што може да се провери со помош на скалата од 100 bp на левата страна на сликата. Првиот, долен опсег на скалилата значи 100 bp, вториот за 200 bp итн. Бидејќи се користеа само прајмери кои покажаа чисти PCR производи во гелот во тест-рок, само една чиста лента може да се види на сите гелови слики на соодветно ниво. Количината зависи од засилената големина на ДНК, што е забележано во списокот на буквар. Контролата на PCR ја покажува точната големина на производот на PCR на сите слики и е негативна за контаминација. - 68 -