Управниот одбор Проф.

Од Клиниката за медицински мали животни, Катедра за интерна медицина на мали миленици и миленичиња на Ветеринарниот факултет на Универзитетот Лудвиг Максимилијанс во Минхен. Катрин Хартман изработена под раководство на проф. Д-р. Катрин Хартман Генетски и хранливи фактори во развојот на дијабетес мелитус кај кучиња: Студии за полиморфизми кај четири гени кандидати и за снабдување со витамин Д Почетна дисертација за добивање на ветеринарен докторат од ветеринарниот факултет на Универзитетот Лудвиг Максимилијанс во Минхен презентирана од Јанис Уриг од Карлсруе Минхен 2007 година

одбор

Печатено со одобрение од Ветеринарниот факултет на Лудвиг-Максимилијанците-Универзитет Минхен Декан: Говорник: Ко-судија: Унив.-Проф. Д-р E. P. Märtlbauer Univ.-Проф. Д-р Хартман Проф. Др. Д-р на Голдберг: 20 јули 2007 година

Знаеме што прави цвеќињата да растат, но не знаеме зошто сите имаме знаење за ДНК, но сепак умираме Justастин Саливан Да се ​​прогласи сомнеж за филозофија на животот е како да се избере застој како превозно средство Јан Мартел во спомен на мојата мајка

4,5. Мерење на 25 (OH) нивоа на витамин Д 3. 61 4.6. Мерење на 1,25 (OH) 2 нивоа на витамин Д 3. 62 V. Дискусија. 64 1. Споредба на методите за генотипизација. 64 2. Етиологија на дијабетес мелитус кај луѓе и кучиња. 65 2.2 Генетски фактори за развој на дијабетес мелитус. 65 2.3 Статус на витамин Д како хранлив фактор во развојот на дијабетес. 68 3. Ограничувања на оваа студија. 69 3.1. Anивотински број. 70 3.2. Колектив на пациенти. 70 3.3. Контролна група. 71 3.4. Дизајн на студија. 72 4. Релевантност на оваа студија. 72 5. Изгледи. 73 VI. Резиме. 76 VII. VIII. Резиме. 78 Библиографија. 80

Азбучен список на кратенки 7-DHC: 7-дехидрохолестерол АДА: Американска асоцијација за дијабетес Возраст: Напреден гликолизиран краен производ ALP: Аланин-аминотрансфераза АП: Алкална фосфатаза АПЦ: АЛГ-клетки што презентираат антигени: Систем за мутација на огноотпорни мутации за засилување ЦТЛА4: Цитотоксичен анти-лим: Праг на циклус ДДГ: Германско друштво за дијабетес ДКА: Дијабетична кетоацидоза ДЛА: Антиген на леукоцити на кучиња Д.м.: Дијабетес мелитус ЕДТА: Етилендиамин тетраоцетна киселина ЕПИ: Егзокрина панкреасна инсуфициенција GAD65: Глутамат хумана декарбоксилаза ГХ: растот на растенијата Леукоцитен антиген IA-2/ICA-512: Тирозин фосфатаза IBD: Воспалително заболување на цревата ICA: Астроген на островските клетки: IDDM: Инсулин-зависен дијабетес мелитус IFN-γ: Интерферон-γ IL-2: Интерлеукин-2 IRD: Дијабетес на отпорност на инсулин ISAG: Меѓународно друштво за животинска генетика ЛАДА: Латентен автоимун дијабетес кај возрасни LYP: лимфоид-тирозин-фосф atase MHC: Голем комплекс за хистокомпатибилност МОДИ: Дијабетес со почеток на зрелост кај младата МС: Мултиплекс склероза

NADPH: намален никотинамид аденин динуклеотид NIDDM: неинсулин-зависен дијабетес мелитус NO: азотен оксид ИЛИ: сооднос на коефициенти NPH: изофан-инсулин PCR: полимеразна верижна реакција ПП: панкреатичен полипептид PTH: паратиреоиден хормон PZI: протамин-цинк-инсулин RX Ретиноиден Х рецептор СД: стандардно отстапување СНП: поединечен нуклеотиден полиморфизам T1DM: тип I дијабетес мелитус TBE: TRIS-борат-ЕДТА ТЕ: TRIS-EDTA TGF-β: трансформирачки фактор на раст β TNF-α: фактор на некроза на тумор-α VDR: витамин Д- ВДР-рецептор: ВИП одговорни елементи на витамин Д: вазоактивен цревен полипептид VUW: Универзитет за ветеринарна медицина, Виена СЗО: Светска здравствена организација

II. Преглед на литература 4 Електронски микроскоп хомогено матно, мали гранули се складираат и сочинуваат околу 5% од островските клетки. Најмалата и многу хетерогена група на ендокрини панкреасни клетки, ПП клетките лачат гастроентеропанкреатични полипептидни хормони, на пример панкреатичен полипептид (ПП) или вазоактивен цревен полипептид (ВИП). Ендокрините клетки на панкреасот се опкружени со густа мрежа на фенестрирани капилари и со егзоцитоза го ослободуваат нивниот секрет во крвотокот. Тие не можат да се разликуваат по боење на хематоксилин-еозин, но можат многу добро да се идентификуваат со имунохистохемиско боење на хормоните што ги произведуваат (MOSIMANN & KOHLER, 1990; SINOWATZ, 2000; BÖCK & LIEBICH, 2004). 1.3. Инсулин Инсулин е пептиден хормон со голема хомологија помеѓу различните видови цицачи. Кучешкиот инсулин е идентичен по својата секвенца со свинскиот инсулин (www.ebi.ac.uk/swissprot). Дејствува преку рецепторот и на хомеостазата на глукозата и на метаболизмот на мастите, протеините и кетонските тела. 1.3.1. Формирање инсулин и секреција на инсулин Инсулинот се формира како пре-инсулин во cells-клетките на панкреасот и се состои од 106 аминокиселини кај кучиња, кои формираат сигнална низа, како и синџир А и Б, кој е поврзан со средна врска, т.н. C- Пептидот да биде поврзан. 82 аминокиселински проинсулин се формира со разделување на редоследот на сигналот и формирање на три дисулфидни мостови. Во понатамошниот тек на процесот, C-пептидот се распарчува и добиениот инсулин, кој кај кучињата се состои од 51 аминокиселина (SMITH, 1966) врзан за јон цинк како хексамер, се чува во гранули на површината на клетката и како реакција на зголемено ниво на шеќер во крвта, се чува заедно со C- Пептид се лачи во крвотокот во еквимоларни количини. Бидејќи формирањето на инсулин од неговите претходници со т.н. прохормонски конвертаза се одвива само во гранулите за складирање, доколку секрецијата на инсулин е брза, проинсулин исто така се ослободува во крвотокот; сепак, има мала биолошка активност. Понатаму, разни протеини од гранулите влегуваат во циркулацијата. На повеќето им е дадена улога во воспоставувањето оптимални услови за складирање и обработка на инсулинот. Сепак, не може да се исклучи дека некои од нив, исто така, можат да покажат биолошка активност. Еден

II. Преглед на литературата 8, како и стеснување на капиларите во гломерулумот и мрежницата. Оваа биохемиска реакција веројатно придонесува за голем дел од долгорочното оштетување на D. m. Познато и стравувано кај луѓето, како што се артериосклероза, дијабетична нефропатија и дијабетична ретинопатија (VLASSARA et al., 1986). Бидејќи сите овие компликации се развиваат само во текот на неколку децении, тие се клинички помалку важни за кучето (FELDMAN & NELSON, 2004). Долгорочните последици од D. m. Релевантни за кучето се опишани во делот 1.6.3. се занимаваа со. Со нормално ниво на шеќер во крвта, само околу 3% од гликозата се распаѓа преку таканаречениот пат на сорбитол преку ензимот алдоза редуктаза до сорбитол и, конечно, до фруктоза. Во хипергликемична состојба, оваа вредност се зголемува до 30%. Бидејќи NADPH (намален никотинамид аденин динуклеотид) се троши кога гликозата се распаѓа преку патот на поли-инозитол, се појавува дефицит на NADPH во клетката. NADPH е подлога за глутатион пероксидаза, која ги штити клетките од слободните радикали, а со тоа и од оштетувања предизвикани од оксидативен стрес. На овој начин, зголемената активност на алдоза редуктаза, за која се сомнева дека е исто така вклучена во формирањето на ГОД, може да придонесе за оштетување на васкуларната ендотелија, а со тоа и на горенаведените компликации на Д.м. кај луѓето (SRIVASTAVA et. ал., 2005). Овие механизми, исто така, се чини дека се од мала важност кај кучешкиот D. м. Поради краткиот век на траење на кучето, но се чини дека патеката на сорбитол игра важна улога во формирањето на дијабетична катаракта и кај кучињата и кај луѓето (ЛАЈТМАН, 1993; Вилки и сор., 2006). 1.5. Епидемиологија на кучешки дијабетес мелитус Според едно американско истражување кое ретроспективно ја споредило распределбата на раси на кучиња со Д.м. Со дистрибуцијата на раси на кучиња претставена на истата клиника од други причини во текот на годините 1970-1999, дванаесет раси имале особено висок ризик од развој на D. m. (австралиски териер, среден шнауцер, самојед, минијатурен шнауцер, фокс териер, кишонд, бичофриз, финенспиц, карен териер, минијатурна пудлица, сибирски хаски, играчка пудлица). Поголемиот дел од кучињата биле на возраст од пет до десет години за време на дијагностицирањето, што е најголема преваленца на D. m. Во возрасната група помеѓу единаесет и 15 години (ГУПТИЛ и сор., 2003).

II. Преглед на литературата 10 1993). Хиперлипидемијата е лабораториски наод што често може да се забележи, бидејќи повеќе слободни масни киселини се акумулираат во случај на недостаток на инсулин како резултат на зголемена липолиза во крвта. Хиперлипидемијата доведува до зголемено складирање на маснотии во црниот дроб, а со тоа и до хепатална липидоза (JAMES & DAY, 1999). Ова доведува до зголемување на активноста на ензимите на црниот дроб алкална фосфатаза (АП) и аланин аминотрансфераза (АЛТ). Во студија со 208 кучиња со D. m., 90% од сите кучиња покажале зголемување на активноста на АП и 78% зголемување на активноста на АЛТ, кај 42% од кучињата серумот бил липемичен (ХЕСС и сор., 2000) . 1.6.2. Основни болести Хормоналните влијанија, лековите и болестите на панкреасот и другите органи можат да доведат до D. m. Во принцип, D. m. Врз основа на инсулинска резистенција е реверзибилна и во случаи во кои постои хиперадренокортицизам или зголемена потреба за инсулин во диеструсот, раниот третман на основната болест или непосредната кастрација понекогаш може да доведе до премин од минлив во трајно манифестиран Д. .м. за да се избегне. Меѓутоа, во повеќето случаи, премногу β-клетки веќе исчезнале поради токсичност на гликоза или исцрпеност на нивниот излачен капацитет со цел да се одржи доволна секреција на инсулин, така што реверзибилниот, отпорен на инсулин Д. м. Станува неповратен дијабетес со дефицит на инсулин (ФЕЛДМАН и НЕЛСОН, 2004 година; НОРМАН и сор., 2006). Акутен и хроничен панкреатит Акутниот или хроничен панкреатит се вообичаени болести кои ги уништуваат ендокрините клетки на панкреасот и со тоа доведуваат до недостаток на секреција на инсулин; ретко се појавуваат неоплазми на егзокриниот панкреас (ALEJANDRO et al., 1988). Акутниот панкреатит има тенденција да доведе до брзо уништување на β-клетките и со тоа до недостаток на секреција на инсулин, додека хроничниот панкреатит е најважната причина за инсулинска резистенција поврзана со воспаление (FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.2.2. Хиперадренокортицизам Глукокортикоидите, произведени од телото или испорачани јатрогено, доведуваат до зголемување на нивото на шеќер во крвта преку зголемена гликогенолиза и глуконеогенеза. Тие дејствуваат како антагонист на инсулин и можат да доведат до D. m. Понатаму, глукокортикоидите доведуваат до а

II. Преглед на литературата 14 микроалбуминурија, постои зголемено производство на трансформирачки фактор на раст β (TGF-β). Овој фактор на раст е одговорен за зголемено вонклеточно таложење на матрикс протеини во гломерулумот; ова доведува до задебелување на основната мембрана и проширување на мезангиумот (SCHENA & GESUALDO, 2005). Бидејќи времетраењето на почетната фаза е околу пет години, а дијабетичната нефропатија е целосно развиена по околу 20 години, таа се јавува многу ретко како резултат на пократкиот животен век на домашните кучиња (STRIPPOLI et al., 2003; FELDMAN & NELSON, 2004). 1.6.3.6. Дијабетична кетоацидоза DKA е опасно по живот излегување од шините на метаболизмот во организмот поради нетретирана или слабо контролирана D. m., Карактеризирана со биохемиска тријада на хипергликемија, ацидоза и кетоза. Како што веќе е опишано, недостаток на инсулин и гликоза во периферните клетки на телото доведува до зголемена липолиза и формирање на кетонски тела во црниот дроб, бидејќи слободните масни киселини се оксидираат во ацетил-CoA, што не се додава во циклусот на лимонска киселина поради недостаток на гликоза во клетката и се метаболизира во слабите киселини ацетон, ацетоацетат и β-хидроксибутират. Овој ефект се интензивира со зголемена концентрација на антагонистички хормони на инсулин (особено глукагон и глукокортикоиди) и зголемена глуконеогенеза и гликогенолиза доведува до понатамошно зголемување на нивото на шеќер во крвта. Ова доведува до осмотска диуреза, губење на електролити и дехидрираност (SONKSEN & SONKSEN, 2000; GOODMAN, 2003). Кетонските тела можат да ги користат многу клетки на телото, вклучително и оние во мозокот, за да генерираат енергија, но доколку се формираат прекумерно, тие придонесуваат за сериозно нарушување на метаболизмот во телото. Тие дејствуваат како слаби киселини и затоа доведуваат до исцрпување на тампон-системите во крвта, а со тоа и до метаболна ацидоза. Тие слободно се филтрираат низ гломерулумот и, поради нивната хидрофилност, ја интензивираат осмотската диуреза. Поради негативниот полнеж на кетонските тела, катјоните како што се натриум и калиум, но исто така и калциум и магнезиум, се лачат од крвта во урината со цел да се одржи електронеутралноста на крвта. Ова доведува до осиромашување на натриумот и калиумот во организмот и понатаму, сериозна дехидратација. Доколку нема наплив на гликоза во телесните клетки, ниту еден калиум не може да влезе во клетката, бидејќи тоа може да се направи со помош на

III. Материјал и методи 40 или беа упатени на клиниката од страна на општите лекари само кога се појавија компликации. 1.1.3. Дистрибуција на раса и пол 13 кучиња беа мешани раси; најчесто застапени педигре кучиња биле дакели, бели териери и пудлички од Западен Хајленд (по четири пациенти) и германски овчари (тројца пациенти, види табела 2). Мали раси на териер (Западни Хајленд Бели териери, Јоркшир териери, Jackек Расел териери, како и велшки териери и шкотски териери со вкупно десет пациенти) беа најчесто претставени. Расите на кучиња од Медицинската клиника за мали животни во Минхен се наведени одделно во Таб. 3 со цел да можат да се споредат со најчестите раси на целата популација на пациенти на Клиниката за медицински мали животни за време на периодот на студирање. 28 кучиња со Д.м. беа женки, од кои 15 беа кастрирани и 13 некастрирани, 23 кучиња со Д.м. беа машки, од кои единаесет беа кастрирани, а дванаесет не беа. Таб. 2: Најчести раси на кучиња со дијабетес мелитус (цела популација на студии) Број на раса Мешана раса 13 дакел 4 пудлица 4 западен хајленд бел териер 4 ротвајлер 3 германски овчар 3 териер од Јоркшир 2 Jackек Расел териер 2 други 16

III. Материјали и методи 50 се зголемуваат. Бидејќи ефикасноста на врзување на прајмерите беше различна, вредностите на C t се разликуваа и покрај истата количина на ДНК во различните алели, поради што Ct 1 C) треба да се разликува во нивната температура на топење. Оптималната температура за ленење и концентрацијата на специфичните алелни буквари мора да бидат оптимизирани во неколку прелиминарни тестови (LINDBLAD-TOH et al., 2005). Функционален пристап може да се воспостави само за една од СНП; букварите и условите за реакција се дадени во Таб. PCR беше извршена на плочи со 96 бунари (Thermowell Gold PCR Plates, Corning Inc., Corning, USA) со термички циклус AB 7300 (Applied Biosystems, Foster City, USA). По PCR следуваше чекор на дисоцијација во кој се одредуваше температурата на топење на производите на PCR со употреба на температурен градиент (60-95 C). Или негативниот прв дериват на кривата на флуоресценција покажал врв на пониска температура на топење, потоа пократкиот ампликон бил засилен и примерокот содржел аденин или тимин на местото на СНП, или имало врв со повисока температура, тогаш примерокот бил хомозиготен за гванин или цитозин. Хетерозиготни животни покажаа два врва, по еден врв на соодветната температура. Букварите се добиени од Operon Biotechnologies GmbH во Келн, Германија. Користена е Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, САД). За да може да се спореди овој нов метод на генотипизирање со ARMS-PCR, SNP V7 беше генотипизиран со користење на двата методи.

III. Материјал и методи 55 Табела. 9 СНП V7 Крива на топење PCR; Буквар, програма за PCR, мешавина на реакција, отпечатена со задебелени букви: Основна размена Буквар 1 (специфичен за алелот) GCGGGCAGGGCGGCCCTGGCTAGCCCTGAC Primer 2 (специфичен за алелот) GCGGGCCCTGGCTAGCCCTGAT заеднички прајмер AGTCAGGTGCCCTCCTCCTTTGG Почеток на циклусот 95 60 сек синтеза 72 C 30 сек серија H 2 O 7,8 μl (20 μl) прајмер 1 (10 μm) 0,4 μl буквар 2 (5 μm) 0,4 μl заеднички прајмер (10 μm) 0,4 μl 2x SYBR-Green Mastermix 10 μl ДНК-образец 1 μl 2,8. Статистика Статистичката евалуација е извршена со SPSS за Windows, верзија 13.01 (SPSS Inc., Чикаго, САД). За споредување на средните вредности на витамин Д се користеше непаруваниот студентски т-тест и тестот χ 2 за споредување на алелните фреквенции. P од 0,05 се сметаше за значаен. Анализата на јачината на тестот и потребниот број на животни беше извршена со Power And Precision (Biostat Inc., Englewood, САД).

IV. Резултати 56 IV. Резултати 1. Парови на секвенционирање на буквар беа создадени за вкупно 18 делови од гените на VDR, CTLA4, LYP-PNP и DLA, деловите беа засилени со помош на PCR и прочистената, реплицирана ДНК беше секвенцирана. Паровите за почетници беа избрани така што да се засилат што е можно повеќе делови од сите егзони и границите на егзон-интронот. 1.1. Секвенционирање на генот на рецептори на витамин Д Кога ќе се споредат секвенцираните генски сегменти, се пронајдени седум SNP во генот VDR, три од нив во интрони, три во егзони и еден во непреведениот регион 5 (слика 1). Сл. 1: Полиморфизми на единечни нуклеотиди (стрели) во генот на рецептори на витамин Д (кодирачки региони (егзони) прикажани со сиви кутии) 1.2. Секвенционирање на генот на цитотоксичен Т-лимфоцит антиген 4 Две СНП се пронајдени во генот CTLA4, еден во егзон 2 и еден во егзон 4 (Слика 2). Сл. 2: Полиморфизми на единечни нуклеотиди (стрели) во генот на цитотоксичен Т-лимфоцит антиген 4 (области за кодирање (егзони) прикажани со сиви кутии)

IV. Резултати 57 1.3. Секвенционирање на генот на лимфоидната тирозин фосфатаза СНП е пронајдено во генот LYP, тој се наоѓаше во егзон 13 и резултираше во размена на аминокиселини (фенилаланин> леуцин). Сл. 3: Единствени нуклеотидни полиморфизми (стрели) во генот на лимфоидната тирозин фосфатаза (области за кодирање (егзони) прикажани со сиви кутии) Сите СНП со точна локација и именување според номенклатурата на Друштвото за варијации на човечки геном (HGVS) наведени во Таб. 10. Таб. 10 Локализација на поединечни нуклеотидни полиморфизми (СНП) (UTR = Непреведен регион, AS-Aust. = Размена на аминокиселини, PPA = Primer-Probe-Assay, ARMS = Amplicon Mutation Refractory System-PCR, TM = Meltingcurve-PCR, Phe = Фенилаланин, Leu = леуцин) СНП-регион ген AS-Aust. PCR V1 c.-21t> c 5 'UTR VDR - PPA V7 c.501 + 3310A> G Intron 3 VDR - ARMS/TM V8 c.501 + 3434c> t Intron 3 VDR - ARMS V9 c.533c> t Exon 4 VDR - секвенциониран V10 c.677t> c exon 5 VDR - ARMS V11 c.761t> c exon 5 VDR - ARMS V13 c.1150 + 1580a> g intron 7 VDR - ARMS C1 c.372c> t exon 2 CTLA4 - PPA C2 c.958a> g exon 4 CTLA4 - ARMS LYP c.2344a> t exon 13 LYP-PNP Phe> Leu PPA