Влијанието на мастоцитата врз заздравувањето на кожните рани на раните на кожата заразени со Pseudomonas aeruginosa

Од Клиниката за дерматологија, венерологија и алергологија на Медицинскиот факултет Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Влијанието на јарболот врз кожното заздравување на раните на кожата заразени со Pseudomonas aeruginosa за стекнување со академска диплома на лекарски лекар (д-р. Медицински студенти) Тролц од Карл-Маркс-Штад/сега Кемниц Датум на докторат: 04.09.2015-1 -

влијанието

Посветен на моите родители Рецензент: 1. 2. 3. Датум на докторат. - 2 -

Резиме на содржина. Апстракт Поставување на цел. 1. Вовед. 1 1.1. Основи на биологијата на мастоцитите. 1 1.1.1. Вовед. 1 1.1.2. Карактеристики на мастоцитите. 2 1.1.3. Модел на дистрибуција и хетерогеност. 3 1.1.4. Потекло и развој. 5 1.1.5. Физиологија и функции на мастоцити. 7 1.1.6. Имунолошки компетенции на мастоцитата. 11 1.2. Улога на мастоцитата во природниот имунитет на бактериите. 12 1.2.1. Генерал 12 1.2.2. Бактеријата Pseudomonas aeruginosa. 14 1.2.3. Антимикробни пептиди и МЗ протеази, како и нивната улога во имунолошката одбрана со посредство на МЗ. 15 1.3. Кожно заздравување на раните. 16 1.3.1. Преглед 16 1.3.2. Фази и механизми на заздравување на раните. 17 1.3.3. Лекување на рани и мастоцити - состојба на истражување. 20 2. Материјал и методи. 22 2.1. Ивотни. 22 2.1.1. Комплет W/комплет W-v - модел на глувче. 22 2.1.2. Реконституција. 23 2.2. Експеримент за заздравување на раните со глувци од див тип и со недостаток на МЗ. 23 2.2.1. Анестезија. 23 2.2.2. Рани, инфекции и контрола. 23 iii

2.2.3. Мерење на раната. 24 2.2.4. Хистологија. 25 2.3. Бактериско оптоварување на раната. 26 2.4. Клетки. 27 2.4.1. Добивање и култивирање на култивиран МЗ (BMCMC) добиен од коскена срцевина. 27 2.4.2. Добивање на перитонеални мастоцити (ПМЦ). 28 2.4.3. Одделување на магнетни клетки (MACS). 28 2.4.4. Одгледување на PCMC. 28 2.4.5. Анализа на факти. 29 2.5. Одгледување на културата на Pseudomonas aeruginosa. 30 2.6. Анализа на β - хексосаминидаза. 30 2.7. Одредување на стапката на преживување на бактериите. 31 2.8. Цитоспин. 32 2.9. Квантитативна PCR во реално време (q-RT-PCR). 32 2.9.1. Буквар. 32 2.9.2. Стимулација на PCMC. 34 2.9.3. Изолација на РНК. 34 2.9.4. Одредување на чистотата и концентрацијата на РНК. 35 2.9.5. Препиши во ЦДНА. 35 2.9.6. ПЦР постапка со LightCycler. 36 2.10. Статистичка анализа. 37 3. Резултати. 39 3.1. Текот на заздравување на раните кај глувци со комплет МЗ со комплет W/Kit W-v по инфекцијата со бактеријата Pseudomonas aeruginosa е одложен. 39 3.2. Нормалното заздравување на раните на заразените рани од Pseudomonas aeruginosa зависи од мастоцитите. 43 3.3. Хистолошка потврда за успешна реконституција на М-дефицитарни комплет W/комплет W-v - глувци со BMCMC. 46 3.4. Animивотните со рани инфицирани со ПА не покажуваат системски знаци на инфекција. 49 iv

3.5 МЗ го намалува бактериското оптоварување на раните инфицирани со Псевдомонас аеругиноза. 51 3.6. Бактеријата Pseudomonas aeruginosa и нејзините компоненти не доведуваат до дегранулација на култивирани, перитонеални мастоцити (PCMC). 53 3.7. МЗ ја намалува стапката на преживување на бактеријата Pseudomonas aeruginosa во кокултурата. 55 3.8. Откривање на експресија на избор на антимикробни пептиди и протеази што ги лачи МЗ по стимулација со ЛПС и ПА. 57 3.9. Pseudomonas aeruginosa и LPS го менуваат изразот на MZ-специфични протеази и антимикробни пептиди во мала мерка по 4 и 24 часа стимулација. 59 3.10. Одгледувани перитонеални мастоцити како модел за мастоцити на кожата. 61 4. Дискусија. 64 5. Библиографија. 77 6. Доверба. 99 7. Биографија. 100 8. Признанија. 101 п.н.е.

Цел in vivo: 1. Презентација на промената на склоноста на заздравување на раните кај диви типови Kit +/+ - и MZ-дефицитарни комплет W/Kit Wv глувци по инфекција од бактеријата Pseudomonas aeruginosa (pa) глувци со дефицит со употреба на BMCMC 3. Компаративно одредување на оптоварувањето на бактериите кај раните на глувци Кит +/+ - и Кит W/Кит Wv - по 24 часа инфекција со ПА ин витро: 4. Истражување на активирањето на МЗ од ПА, како и од избраните компоненти на оваа бактерија 5. Квантитативно откривање на директна елиминација на ПА од МЗ во кокултура 6. Идентификација на секретирани антимикробни пептиди или протеази на МЗ по бактериска стимулација и квантифицирање на изразувањето на овие со помош на квантитативно PCR viii во реално време

Табела 1 Карактеристики на мукозна мукоза и мастоцити на сврзно ткиво (Гали, 1990) Мукоза МЗ (ММЦ) Сврзно ткиво МЗ (ЦТМЦ) Појава Бронхијален епител, цревна лигавица Кожа, бели дробови, перитонеум ifивотен век околу 40 дена Неколку месеци до години Ултраструктура на гранулите Мали, хетерогени електронски Голем, хомоген, зависен од електрони Т-клетки зависни Т-Да Да Не Најистакнат интрагрануларен протеогликан Хондроитин сулфат Хепарин Може да се обое со алзинско сино, алзино сино, берберин сулфат, сафранин Содржина на хистамин во гранули Ниска висока содржина на серотонин во гранулите Ниска варијабилна Присуство на висок афинитет Да 48 Да, во рамките на популациите на човечки мастоцити, се прави разлика во однос на моделот на изразување на триптаза и химаза, две познати протеизи на мастоцити. Триптаза-и-химаза-позитивните клетки се наоѓаат во кожата, додека триптаза-позитивните мастоцити доминираат во белите дробови (Irani et al., 1986; Miller and Schwartz, 1989; Welle et al., 1997). - 4-ти -

PCR е оценета со употреба на релативна квантификација врз основа на β-актин како ген за домаќинство, со којшто односот на стимулиран до нестимулиран примерок (сооднос) може да се одреди со користење на следниве формули: Сооднос = 2 -ΔΔCt ΔΔCt = ΔCt (стимулиран) - ΔCt ( нестимулиран) ΔCt = Ct (целен ген) Ct (ген за домаќинство). Ct вредноста (праг на циклус) го опишува циклусот на PCR на кој флуоресценцијата значително се зголемува за прв пат. 2.10 Статистички анализи Статистичката евалуација на резултатите од оваа работа е извршена според следниов метод: Пресметка на средната вредност М: М 1 ннкси 1 н Број на измерени вредности xi Вредност на измерената вредност i Стандардно отстапување СД на средната вредност: СД 1 н 1 бргу М и 1 2 Стандардна грешка СЕМ де Средна вредност: SD SEM n - 37 -

Сите групи на податоци беа анализирани за значење користејќи двостран студентски тест за неповрзани примероци: Пресметка на вредноста: t M 2 1 1 1 SD n M 2 SD n 2 2 2 M 1: средна вредност на примерокот 1 М 2: средна вредност на примерокот 2 SD 1 Стандардна девијација на просечните вредности на населението 1 SD 2 Стандардна девијација на просечните вредности на населението 2 n 1 Број на измерени вредности во примерокот 1 n 2 Број на измерени вредности во примерокот 2 Вредност на веројатноста ([p]) од p 0,05 како незначителна прегледано. Сите податоци беа презентирани како средна вредност ± SE. Статистичките анализи беа извршени со помош на компјутерскиот софтвер Statview (Statview for Windows, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). - 38 -

Слика 1а комплет +/+ (не е заразен) 1,5 см 0ч 6ч 12ч Ден 1 ден 2 ден 3 ден 4 ден 5 ден 6 ден 7 ден 8 ден 9 комплет +/+ (заразено) 1,5 см 0 час 6ч 12ч ден 1 ден 2 ден 3 ден 4 ден 5 ден 6 ден 7 ден 8 ден 9 слика 1б комплет W/комплет Wv (не е заразен) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h Ден 1 ден 2 ден 3 ден 4 ден 5 ден 6 ден 7 ден 8 ден 9 комплет W/комплет Wv (инфициран) 1,5 1,5 cm cm 0h 6h 12h ден 1 ден 2 ден3 Ден 4 Ден 5 Ден 7 Ден 8 Ден 9 Слика 1 a/b: Областа на раната кај глувците со недостаток на МЗ заразени со Pseudomonas aeruginosa е зголемена. Овие рани биле заразени со 10 μl на суспензија на Pseudomonas aeruginosa (PA) во концентрација од 6,5 × 10 5 PA/10 μl или со 10 μl PBS како негативна контрола и фотографирани во опишаните временски интервали. Репрезентативните слики на затворањето на раната на едно животно во одредено време се прикажани со идентична скала од 1,5 см. Слика 1а комплет од див тип +/+ - глувци, Слика 1б Комплет W/комплет W-v - глувци со недостаток на МЗ. - 41 -

* ** ** * * * * * * Слика 2: Процесот на заздравување на раните на раните заразени со Pseudomonas aeruginosa се одложува кај глувци со комплет М/дефицит на W/Kit W-v. Инфицирани комплет глувци +/+ (n = 9), инфицирани глувци со комплетно М-дефицитарно W/Kit Wv (n = 6) и соодветните контроли (n = 10 или n = 6) беа индивидуално третирани со рани во опашката на задниот дел Лекувањето е документирано. Илустрацијата го покажува процесот на заздравување на раните во текот на 9 дена, исцртан како процент на површина на рани со удари на раните на 0 ден. Податоците се сумираат од 2 независни експерименти, со n = 6-10 животни по група и се дадени како средна ± СЕМ; * = p 1 одговара, на пример, со триптаза 1 под LPS (2,9 пати ± 1,3 SEM) и PA (2,2 пати ± 0,3 SEM), катепсин G под LPS (2,2- пати ± 1,0 SEM) и PA (1,4 пати ± 0,1 SEM), MCPT8 под LPS (2,6 пати ± 0,8 SEM) и PA (1,6 пати ± 0,2 SEM) ), MCPT9 под LPS (3,1 пати ± 1,5 SEM), како и Granzym B под LPS (2,0 пати ± 0,6 SEM) и под PA (2,9 пати ± 1,5 SEM) . Спротивно на тоа, изразот на MCPT9 беше регулиран под стимулација на PA (0,7 пати ± 0,1 SEM). Намалување на регулацијата на одредени протеини и протеази е предизвикана од вредностите