Влијанието на пренаталниот стрес врз миелинизацијата и формирањето на нервната мрежа
1 Влијанието на пренаталниот стрес врз миелинизацијата и формирањето на нервната мрежа во мозокот на феталните овци Дисертација за добивање на академска диплома лекар medicinae (д-р med) доставена до Советот на Медицинскиот факултет на Универзитетот Фридрих Шилер во Јена од iaулија Квенд, родена на 05. Септември 1987 година во Гота
2 рецензенти: 1. Проф. медицински Матијас Шваб/Јена 2. Проф. медицински Ричард Бергер/Новид 3. ПД Др. медицински Ден на јавната одбрана Бернд Ромејке/Јена:
3 содржини Содржина I СПИСОК НА АБРЕВИЈАЦИИ I 1 РЕЗИМЕ 1 1 ВОВЕД Клиничко значење на пренаталниот стрес за развој на клетки на ембрионален развој на мозокот во фетален мозочен развој Имиграција на неврони и глијали Структура на церебрална миелинизација и биохемиска композиција на миелиене Ефекти на миелинизација на пренаталниот стрес врз развојот на мозокот кај фетусот Церебрални ефекти на стресот кај мајката Церебрални ефекти на пренатална терапија со глукокортикоиди Регулирање на стресната оска Ефекти на стресот кај мајката и пренаталната глукокортикоидна терапија врз развојот на стресната оска Механизми на ефектите од пренаталниот стрес Пренесување на мајчиниот стрес на фетусот на глукокортикоиди Пренатален стрес и хормони за раст Цел на тезата 22
4 Содржини 3 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ Експериментален експериментален протокол Извлекување на феталниот мозок и подготовка на примероците Хистохемиско и имунохистохемиско боење Преглед на боење со хематоксилин-еозин Сребрена импрегнација според Bielschowsky пренатален стрес церебрални ефекти на пренатален стрес формирање на нервни процеси во белата маса субкортикална бела материја корпус калозум длабока бела материја корона радијата капсула интерна миелинизација на нервните процеси во бела материја субкортикална бела материја корпус калозум длабока бела материја - корона радијата капсула интерна формирање на нервни структури во Хипокампус (регионот CA3) 64
5 Содржина 5 ДИСКУСИЈА Дискусија за методите животински модел Стресен модел Хистологија Квантитативна анализа на слика Дискусија за резултатите Пренаталниот стрес и растот на фетусот Ефекти по пренаталниот стрес на хипокампусот Церебрални ефекти по пренаталниот стрес на нервната мрежа Церебрални ефекти по пренаталниот стрес на миелинизација 82 6 ЗАКЛУЧОЦИ 84 7 8 ПРИЛОГ Декларација за признанија за честа 103
6 Список на кратенки Список на кратенки ABC ACTH ADHD AK AP AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN -аксија 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Adrenocorticotropic хормон Дефицит на внимание/нарушување на хиперактивноста Антитела работен пуфер Работен пуфер + Triton-X-Тритон-X + Тритон + Серум Аква дестилата (дестилирана вода) аргинин-вазопресин бетаметазон 2-3-Цикличен нуклеотид 3 -фосфохидролаза (плацентарна) кортикотропин-ослободувачки хормон глукокортикоиден рецептор на гестација ден (и) хематоксилин-еозин хипоталамистички хипоталитик Хидроксистероид дехидрогеназа тип 2 Инсулин фактор на раст како гликопротеин поврзан со миелин, миелин базен протеин миелин/олигодендроцитен гликопротеин минералокортикоиден рецептор Средна вредност Олигодендроцитен миелин протеин Фосфат пуфер Протеолипиден протеин Брзо движење на очите Температура на собата Стандардна грешка на просечната вредност
18 2 Индукција на первентрикуларна леукомалација (оштетување на белата маса за време на предвремено породување) околу времето 0,65 од бременоста (што одговара на гестациската недела кај човечкиот фетус), висок степен на споредливост на развојот на мозокот помеѓу феталните овци и луѓето. Ова беше поткрепено со фактот дека во овој временски прозорец започнува созревањето на олигодендроцитите во феталниот мозок на овците и во исто време може да се забележи голем ризик од оштетување на незрелите, перивентрикуларни, бели материи кај недоносени бебиња (Back et al., 2006, 2001) . За време на раѓањето, мозокот на создаденото лице покажува нешто повисок степен на зрелост отколку кај луѓето (Мекинтош и сор. 1979, Астром 1967). Ова може да сугерира дека креативниот ум созрева побрзо во последниот триместар. 12-ти
23 2 Вовед координиран физиолошки одговор на различни концентрации на кортизол (Поглавје 2.4.2). Сл.2.3: Хипоталамус-хипофиза-надбубрежна оска и патеки на негативни повратни информации. Кортикотропин ослободувачки хормон (CRH), аргинин вазопресин (AVP), проопиомеланокортин (POMC), адренокортикотропен хормон (ACTH), паравентрикуларно јадро (NPV). Изменето од Метјус
30 2 Вовед покажува сличен временски тек на развој на мозокот кај луѓето, дури и ако созрее малку побрзо. Вкупно, беа оценети мозоците на 45 работници кои беа хронично под стрес помеѓу 0,20-0,66 гестација (180 г.) преку 180-минутна изолација, два дена во неделата. Бидејќи овците се стадо животни, изолацијата е главен стрес за овој вид. Со цел да се прикажат можни трајни ефекти, мозоците биле оценети во времето 0,73 (110 ГТ, времетраење на бременоста 150 дена) и 0,86 гестација (130 ГТ). Резултатите имаат за цел да помогнат да се разјаснат ефектите на пренаталниот стрес врз функцијата на мозокот во подоцнежниот живот. 24
32 3 Материјали и методи Изолирани во слушалка на други животни, така што на крајот на протоколот секое животно беше изложено на индивидуална изолација 20 пати. Бидејќи овците се стадо животни, тие се особено чувствителни на овој стрес. Мерењата на нивото на кортизол пред и за време на изолацијата го потврдија овој ефект (Rakers et al. 2012). Стрес група Контролна група Синхронизација на циклусот еструс и закажано парење ВО СПОРЕДУВАЕ Соодветно одгледување од слободен опсег кај овчар Транспорт на бремени животни во тест-лабораторија Стрес преку изолација 2 пати неделно за 3 часа Хронична инструментација Добивање на мозокот на фетусот - Група 1 Добивање на мозокот на фетусот - Група 2 Природен термин за достасување Сл .3.1: Експериментален протокол Помеѓу 100-тиот и 110-тиот ГТ, фетусите биле инструментирани со употреба на катетри, кои биле користени за проверка на реакциите на интраутериниот стрес (ослободување на ACTH и кортизол). Нивната проценка не е предмет на ова дело (види Rakers 2012). По завршувањето на експериментите и оперативниот развој на фетусите, беа утврдени тежината на нивното тело и мозок. Овие мерења беа направени на 26
36 3 Материјал и методи на растечка алкохолна серија дехидрирани и затворени со монтажен медиум Neo-Mount (MERCK GmbH, Дармштат, Германија). Деталниот протокол на боење е прикажан во Табела 3.2. Средно дексимирање: 2x Neoclear 2x изопропанол 100% 1x изопропанол 80% 1x изопропанол 50% дестилирана вода. Импрегнација со сребро: AgNO 3 20% 2x аква дест. Амонијак раствор на сребро нитрат дестилирана вода + nh 3 (4: 1) Na тиосулфат 5% дестилирана вода од чешма. Дехидратација: изопропанол 50% изопропанол 80% 2x изопропанол 100% 2x Неоклеарно вклучување на балзам со ентелано време [мин]/темп. [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90///RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Табела 3.2: Протокол за импрегнација на сребро според Bielschowsky. RT собна температура. Растворите се подготвуваат на следниов начин: 20% раствор на сребро нитрат (AgNO 3): 100 ml дестилирана вода g сребро нитрат 5% натриум тиосулфат (Na 2 S 2 O 3): 100 ml дестилирана вода. + 5 g натриум тиосулфат за раствор на развивач: 25 ml дестилирана вода, mg лимонска киселина (Fluka Chemie, Buchs, Германија) + 5 ml 36% формалин (Carl ROTH GmbH, Карлсруе, Германија) + 8 μl концентрирана азотна киселина HNO 3 (Fluka Chemie), Бухс, Германија). 30-ти
40 3 Материјал и методи 2xAP + T ABC комплекс: АП + Т + раствор А + раствор Б АП + Т 2х PBS дестилирана вода. 3'3-диаминобензидин (DAB) 2x аква дест. Дехидратација: изопропанол 50% изопропанол 80% 2x изопропанол 100% 2x Неоклеар 100% вклучување на балзам со Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20 μl од растворот A и B во 1 ml AP + T 1Set (H2O2 + DAB) за 5 ml дестилирана вода, филтрирајте со филтер Millipore Табела 3.3: Протокол за имунохистиохемиско откривање на MBP. Растворите се подготвуваат на следниов начин: Цитратен пуфер: 1 литар дестилирана вода. + 2,94 g натриум цитрат (Fluka Chemie, Бухс, Германија), pH 6,0. PBS: 1 литар дестилирана вода. + 1 g работен пуфер D-PBS: 500 ml PBS + 2,5 g серумски албумин од говеда (албумин од говедски серум, минимум 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Стернхајм, Германија) μl TWEEN 20 (полиоксиетилен сорбитан монолаурат) (Сигма-Алдрих хеми GmbH, Стернхајм, Германија) ph 7.5. Раствор DAB (подлога Sigma Fast DAB): 2 таблети (уреа водороден пероксид и 3,3-диаминобензидин) во 5 ml дестилирана вода. се врти додека готовите таблети не се растворат целосно. 34
42 3 Материјал и методи Сл.3.3: Боење со преглед на H&E изменето, според The Sheep Brain Atlas, Michigan State Unversity Bio Biodiversity Bank, National Science Foundation Left: Subcortical бела материја во фронталниот кортекс: во близина на кортексот [1] и оддалечена од кортексот [2]; Корпус калозум [3]; Корона радијата [4]; Внатрешна капсула [5]; СВ: странична комора. Десно: регионот CA3 во хипокампусот: вентрален дел [1], дорзален дел [2] 36
43 3 Материјал и методи По дигиталното складирање, снимките беа оценети во програма за обработка на слика (Scion Image 1,62 NIH, САД). Прво, сликите во боја беа претворени во црно-бели слики со 256 нивоа на сива боја. Областа на позитивното обележување во рамките на репрезентативниот дел е утврдена со анализа на слика. Областа на импрегнација со имуноабела/сребро ја рефлектира имунохистохемиската дистрибуција на антигенот/густината на клеточните процеси. Во споредба со микроскопската слика, горната и долната вредност на прагот беа поставени под визуелна контрола. Овие вредности на прагот формираат опсег за селективно претставување на позитивната имунореактивност на МБП или на нервните влакна во сребрена боја. (види слика 3.4, црвена ознака). Сл.3.4: Анализа на слика со помош на сиви вредности А: Микроскопска слика: Невронски процеси во субкортикалната бела маса на далечинскиот управувач на фронталниот кортекс од кортексот. 37
44 3 Материјал и методи Б: Означување на екстензии на обоени клетки на сликата во сива скала Во споредба со микроскопската слика, во сивата слика е дефинирано сиво подрачје (обележано со црвено на сликата) што одговара на позитивниот сигнал на сребрената импрегнација. Оваа област се мери со програмата за анализа на слика. 38
61 Површина на MBP- IR [10-3 mm²] 4 резултати Субкортикална бела материја - во близина на кортексот 1,00 0,50 $ $ $ $ $ $ (n = 9) (n = 11) Контролен стрес (n = 15) (n = 10) 0, гестациска возраст [d] Сл.4.18: Ефекти на возраста и стресот врз миелинизација на невронските процеси во субкортикалната бела маса на фронталниот кортекс во близина на кортексот. MW ± СЕМ. $ $ $ 62 62 Резултати Клеточните тела и нервните процеси во субкортикалните бели материи оддалечени од кортексот се јасно означени како МБП-позитивни (Слика 4.19). Сл. 4.19: Микрофотографии на нервните процеси во субкортикалните бели материи на далечинскиот управувач на фронталниот кортекс. Имунохистохемиско откривање на МБП. Невронски процес Клеточно тело А: контролно животно на ден на бременост 110 Б: животно под стрес на ден на бременост 110 Ц: контролно животно на ден на бременост 130 Д: животно под стрес на ден на бременост 130
72 Површина на импрегнација на сребро [10-3 mm²] 4 резултати 1,50 регион на хипокампус CA 3, вентрален дел 1,00 0,50 $ (n = 9) (n = 7) (n = 6) * (n = 8 ) Контролирајте го стресот 0, гестациската возраст [d] Сл.4.29: Ефекти на возраста и стресот врз нервната мрежа во регионот на хипокампусот CA3, вентрален пресек. MW ± СЕМ; * стр 73 4 Резултати Сл. 4.30: Микрофотографии на невронската структура во регионот на хипокампусот CA3, дорзален пресек. Импрегнација со сребро. Ellелија со јадро Невронски процес А: контролно животно на ден на бременост 110 Б: стресно животно на ден на бременост 110 Ц: контролно животно на ден 130 од бременост Д: стресно животно на ден на бременост 130