Апоптозата на кератиноцитите оди со инфилтрација на cd8 лимфоцити и акумулација

предмети

апстрактен

Имунопатоморфолошкото боење на примероци од ткиво овозможува микроскопска проценка на морфолошки детали, фенотипови и присуство на маркери за активирање во инфилтрирачки клетки. Присуството на лимфоцити, главно ЦД8 +, близу епителните клетки на кожата1 и присуството на единечна клетка апоптоза се индикативни за акутен ГВДД.23. Региони на нуклеоларен организатор (НОР) на базалните клетки се силно обоени во биопсии на кожата. Акутната акумулација на ГВХД .4-НОРС ги карактеризира клетките во клеточниот циклус.5 Се толкуваше како знак на зголемена стапка на пролиферација на кератиноцити на кожата кај акутни лезии на ГВХД. Акумулацијата НОР покажува дека клетките се во клеточниот циклус, но ова може да не биде завршено со успешна митоза. Ако клеточната делба не може да се заврши, процесот завршува со апоптоза

Во оваа работа истражувавме врска помеѓу степенот на инфилтрација на лимфоцити и присуството на Ки67 + и апоптотични клетки во биопсии на кожата добиени од акутни пациенти со ГВХД. Покрај тоа, беше оценета позитивноста на PCNA, циклин А и циклус на клеточна поделба 2 (cdc2) на кератиноцити. Оваа комплексна анализа покажа оштетување на циклусот на раст на кератиноцити кај пациенти по БМТ, што веројатно промовира апоптотски процеси поврзани со степенот на локална инфилтрација на клетките ЦД8 +.

Пациенти и методи

Трпелив

Осумнаесет случаи (10 возрасни и 8 деца) со хронична миелоидна леукемија (n = 6), акутна леукемија и миелодиспластичен синдром (n = 7), апластична анемија и фанкони анемија (n = 5) беа идентификувани или со БМ (12 пациенти) или со PBPC (5 пациенти). Еден пациент (ХМЛ) добил PBPC од неговата мајка (алтернативна трансплантација на донатор) (Табела 1).

Режимот на кондиционирање се состоеше од бусулфан (BU) 4 mg/kg телесна тежина и циклофосфамид (CY) 50 mg/kg телесна тежина, администриран 4 дена (вкупна доза 16 mg/kg телесна тежина и 200 mg/kg телесна тежина BU или CY) за осум пациенти со леукемија со стандарден ризик или BU 4 mg/kg телесна тежина во текот на 4 дена (вкупна доза 16 mg/kg телесна тежина) и CY 60 mg/kg во текот на 2 дена (вкупна доза 120 mg/kg телесна тежина), дополнета со 5-15 mg/kg телесна тежина етопозид во 2 Дена (вкупна доза од 10-30 мг/кг р.) Или 250 мг/м 2 тиотепа за 3 дена (вкупна доза 750 мг/м 2) кај три или двајца пациенти со низок ризик. Случаите на ФА добиле 5-15 мг/кг телесна тежина анти-тимоцитен глобулин (АТГ, Фрезениус, Бад Хомбург, Германија) 5 последователни дена (вкупна доза 25-75 мг/кг телесна тежина) и ЦИ 20 мг/кг телесна тежина, администрирана во 4 дена (вкупна доза 80 mg/kg телесна тежина). Пациентите со ССА примиле CY во доза од 50 mg/kg телесна тежина за 4 дена (вкупна доза 200 mg/kg телесна тежина) и 5 mg/kg телесна тежина ATG за 5 дена (вкупна доза 25 mg/kg телесна тежина) (Табела 1).

Акутната профилакса на ГВД вклучува циклоспорин А (ЦсА) за намалување на серумските нивоа помеѓу 100 и 200 ng/ml и метотрексат (MTX) во доза од 10 mg/m 2 или 5 mg/m 2 (само пациенти со САА) во денови + Достигнете 1, +3, +6 и +11. MTX беше прекинат во два случаи поради токсичност на мукозата или црниот дроб. Токсичноста е оценета според стандардните критериуми на СЗО. Акутни ГВХД симптоми предизвикаа почеток на третманот со преднизон од доза од 2 мг/кг телесна тежина, што беше зголемено во интервали од 2 дена доколку не се појави реакција.

Биопсии за нормална кожа од четири случаи (на возраст од 15 до 49 години) кои биле подложени на операција на градите за не-малигни и неинфламаторни заболувања биле користени како контроли за студиите за обележување на циклусот на раст. Обележувањето на лимфните јазли со метастатски лезии ја документираше способноста на антителата на циклин А, cdc2 и Ki67 да откриваат клетки во клеточниот циклус (не е прикажано).

Методи

Биопсии на кожата беа земени при првите знаци на лезии на кожата пред или следниот ден (освен во еден случај) по администрација на преднизон (Табела 1).

Делови со дамки со H + E беа оценети според објавените критериуми за акутен GVHD7 и апоптотични лезии.8 Инфилтрацијата на мононуклеарните клетки беше постигната на следниов начин: помалку од пет клетки во кластер, степен 0; 6-20 клетки во кластер, 1 степен; 21 до 50 клетки во кластер, степен 2; Фокусот содржи повеќе од 50 клетки во кластер, одделение 3 и повеќе од еден фокус во ткиво, одделение 4.

Статистичка анализа

За статистички проценка на резултатите се користени тестот Ман-Витни У, точниот тест на Фишер и студентскиот тест за спарени примероци.

Резултати

Секвенцијални биопсии на кожата (замрзнати делови) од пациент со акутен GVHD отпорен на стероиди (UPN 88). Бројот на епителните клетки Ki67 + и апоптотичните клетки се зголеми кога акутниот GVHD беше целосно пораснат (+17 дена наспроти +31 ден по BMT) и повторно се намали во завршната фаза. Акутен GVHD (+45 дена по BMT) (оригинално зголемување 400 ×) .

Акутно блокирање на делови со парафински блокови на GVHD III степен за протеини и апоптотични клетки поврзани со клеточен циклус Забележете акумулација на антиген Ki67, PCNA и циклин А во зголемени клеточни јадра, недостаток на Cdc2-позитивни клетки и голем број на апоптотични клетки во основниот слој на епителот (оригинално зголемување × 400).

Беа изброени позитивни клетки Ki67 и се процени степенот на боење. Фракцијата на клетките Ki67 + во базалниот слој на епидермисот беше слична и кај примероците со и без апоптотични клетки (просечни вредности: 0,25 наспроти 0,2). Сепак, боењето Ки67 + беше многу посилно во ткивните делови со присутни апоптотични клетки. Клеточните јадра беа поголеми и посилно обележани со Ki67 MoAb отколку биопсиите без апоптоза (Слики 1 и 2). Оваа слика е забележана во седум од девет примероци со апоптотични клетки и само еден од девет во ткивни делови без апоптоза (П = 0,008) (Табела 4).

Секвенцијалните биопсии на кожата покажаа дека и бројот на клетки Ki67 + и апоптотичните клетки се зголемуваат како што напредува акутниот ГВХД. Ки67 + клетките во напредната акутна GVHD беа групирани фокусно. Во акутната завршна фаза на ГВХД, и Ки67 + и апоптотичните клетки се намалија со намалувањето на бројот на епидермалните клетки (Слика 1). Боењето на ПЦНА го следеше моделот на Ki67, што беше малку помалку кај биопсиите со токсични лезии за разлика од акутната кожа на ГВХД (не е прикажано).

Пациентите беа групирани според резултатите од боење со TUNEL (Табела 1). Групата 1 се состоеше од пациенти со апоптотични клетки и група 2 од пациенти без апоптотични клетки во нивната биопсија на кожата. Пациенти со апоптотични клетки во биопсии на кожата биле постари од пациенти без апоптотични клетки (просечно полугодие: 24, 8 ± 3, 7 наспроти 15, 2 ± 3, 4 години; P = 0,042) и почесто добивале повеќе токсично кондиционирање, на кои припаѓале етопозид или тиотепа (4/9) наспроти 1/9, НС) (Табела 1). Двата фактори може да придонесат за сериозни токсични мукозни компликации кои се јавуваат почесто во групата 1 отколку во групата 2 (П = 0,013) (Табела 1). Сите пациенти со позитивно боење на кожата за апоптотични клетки (група 1) ги исполнија хистопатолошките и клиничките критериуми на акутен ГВХД. Дури и во акутната фаза на ГВХД, тие беа понапредни од пациентите во групата 2 (П = 0,015) (Табела 1).

Шест акутни GVHD, две биопсии на кожата со токсични лезии и четири контролни примероци на кожа може да се испитаат за боење на протеини поврзани со циклусот на раст во делови од парафински блокови. Кај сите осум примероци (без оглед на тоа дали имале акутен ГВХД или токсични лезии), фреквенцијата на циклин А-позитивни клетки била поголема од онаа на cdc2-позитивните клетки (32% наспроти 8%; P = 0,072) (2 ) за разлика од нормалната кожа, која се карактеризира со слични пропорции на позитивни клетки на циклин А- и цдц2 (3). Преваленцата на циклин А-позитивни наспроти cdc2-позитивни клетки е забележана кај биопсии со акутен ГВХД, без оглед на резултатите од боењето со тунел. Сепак, акумулација на циклин А е забележана кај сите четири биопсии со апоптотични клетки, но не и кај нормална или заболена кожа без апоптотични клетки (осум биопсии) (2 и 3). Моделот на боење циклин А беше сличен на оној на Ki67. Истото беше забележано и со циклин А кога се акумулираше протеин Ki67 (2).

Дамки со нормален блок на парафински блокови се обоени како што е опишано на слика 2. Треба да се напомене дека преваленцата на PCNA во споредба со клетките Ki67 + е позитивна, дека циклините A- и Cdc2-позитивни клетки се присутни во еднакви размери и дека горниот епителен слој е кафеаво (дамки на апоптотични клетки) јадра на апоптоза (оригинал Зголемување × 400).

дискусија

Бројот на апоптотични клетки беше мал и тие беа забележани кај пациенти со поизразена токсичност на мукозата и/или кожата. Тие беа поврзани со сериозноста на акутниот ГВХД и степенот на инфилтрација на лимфоцитите во кожата, но не и со присуството на лимфоцити во епидермисот. Апоптозата е дел од сликата на целосен акутен ГВХД, кој вклучува оштетување на ткивото и инфилтрација на лимфоцитите (Табела 2).

Се чини дека оштетувањето на кожата кај пациенти по БМТ е процес во два чекора. Генотоксична навреда првично влијае на клеточниот циклус и доведува до дефект на границата G 2/M. И покрај релативно високиот процент на клетки кои се или Ki67- (слика 2) или AgNOR-позитивни, ова доведува до ниска митотична стапка на кератиноцити.4 Оваа состојба ги прави клетките подложни на апоптотична смрт. Механизмот со кој крајниот апоптотски хит се доставува до кератиноцитите не може да се заклучи од оваа студија, но најверојатно е поврзан со инфилтрација на лимфоцити. Наместо тоа, ова може да се должи на локално ослободување на воспалителни цитокини, кои може да имаат потенцијал за запирање на растот (на пр., TNFα) 22, но не и од директен ензимски зависен лимфоцитен напад. Гранзим предизвикува апоптотска смрт и бара активност на cdc2 киназа 19, но се чини дека отсуствува во кожата по BMT.