Брза адаптација на достапноста на храната преку морфогенетски одговор со посредство на допамин
предмети
апстрактен
вовед
Интеракциите предатор-плен може да доведат до развојни и морфолошки одговори со значителни еколошки и еволутивни ефекти 1, 2, 3, 4, 5. Одбраната активирана од предатори го намалува ризикот од потрошувачка на плен, додека злосторствата активирани од предатори ја подобруваат потрошувачката или конкурентноста на предаторите 1, 2, 3, 6, 7, 8. Овие фенотипски промени можат да влијаат на трофичните интеракции, динамиката на грабливците и грабливците и динамиката на заедницата и да промовираат спецификации 1, 2, 6. Механистичко разбирање на овие реакции е потребно за да се разбере нивната еволуција, ограничувања, прилагодлива вредност и функционални последици. 12-ти .
Со цел да се направи разлика дали долгите краци се предизвикани со мала густина на храна или, обратно, дали кратките краци се индуцираат со голема густина на храна, потребно е да се утврди основниот механизам за реакција на храната. Со ларвите Strongylocentrotus purpuratus пред хранење, оваа развојна реакција се јавува за неколку дена и бара директно хемосензирање на алгите 15; Оттука, веројатно е да се појави преку невросензорски механизам. Известуваме дека допаминот е невролошки сигнален пат низ кој сензацијата на алгите го менува развојот. Допамин сигнализирање промовира скратување на должината на ларвата рака од развојниот максимум. Затоа, неочекувано, оваа пластичност предизвикана од плен не е навредлив одговор за подобрување на набавките на ресурсите. Преку експериментална манипулација со допамин сигналите и должината на раката, ги проценуваме трошоците, придобивките и ограничувањата на овој фенотипски одговор и обезбедуваме докази дека ларвите на морските ежови можеби избрале широко користен пат за ингестија за развојни одговори.
Резултати
Допамин сигналот предизвикан од алги го инхибира продолжувањето на раката
Контрастни слики на диференцијални пречки на ларвите на крајот на периодот пред хранење, ден 5, култивирани без ( а ) и со ( б ) Алги, почнувајќи од фазата на гастриула. Должината на скелетните елементи по ингестијата и телото се означени со црни линии. Квантификација на ( в ) должина на положбата на раката, што претставува промена од 20,2% (± 3,9%) и ( г. Должина на прачка од тело, што претставува промена од 3,9% (± 1,5%) за ларвите кои биле култивирани со (зелена, n = 20) и без (сина, n = 18) алга. Студентски двостран т-тест, *** П.
( а ) Промена на должината на постуларниот дел од раката и стапот на телото во 5-дневни ларви кои беа третирани со агнист квинпирол со DRD2 во наведените концентрации во споредба со контролата. Еднократна АНОВА за должина на постоперативната рака, Ф 3.463 = 30.586, П.
( а ) Промена на должината на постуелната рака и тело на стап за 4-дневни ларви кои беа култивирани со или без алги како контролна (сина) и преводно блокирачки MASO на третмани од 0,4 mM (TH MASO1, светло сива). ANOVA (Дополнителна табела S2), Третман × Алги за постојални раце, F 1.286 = 19, 604, P 18 (Дополнителна слика С2) и ги проширува процесите по должината на цилијарниот лигамент (слика 4е) што може да бидат вклучени во сензацијата на алгите. Овие податоци се согласуваат со распределбата на допамин-позитивните клетки во ларвите S. droebachiensis 19 и со невросензорната функција. Поголемо зголемување (× 40) на ембриони двојно обоени за допамин и PMC маркер индицира дека допаминските позитивни клетки биле веднаш во непосредна близина на PMC (4g-j). Иако секундарниот ендокрин сигнал 9 честопати е невростимулиран при пластични фенотипски одговори, близината на допамин-позитивните клетки до ПМЦ и надредениот ектодерм во постојалните краци ја зголемува можноста допаминот да сигнализира директно на едниот или двата типа на клетки да го инхибираат растот на раката.
Флуоресцентно имунохистохемиско откривање на ензимот на биосинтеза на допамин биосинтеза што го ограничува стапката ТХ и маркер за PMC (SM30) како референца, 54 часа по оплодувањето (hpf) ( а ) и 60 hpf ( б ) Белите стрели во овие и последователните полиња го означуваат врвот на постералната рака. ( в ) Должина на посторалната рака во споредба со hpf, што покажува истовремен почеток на продолжување на раката и прво откривање на ТХ-позитивни клетки (црна стрелка). Сивата испрекината линија ја означува приближната должина на почетната трирадијација. Лента за грешки ± сем Флуоресцентно имунохистохемиско откривање на допамин ( г. ) и ТХ ( д ) и PMC маркери, Msp130 ( г. ) и SM30 ( д ), во фаза на плутење (92 hpf). Флуоресцентна хибридизација на полно монтирање in situ за откривање на ddc mRNA ( ѓ ) во посторалниот врв на раката и во серотонергичните ганглии (горе на сликата) на раниот плутеус (72 hpf, орален поглед). ( g - j ) Поголемо зголемување на сликите на допамин и PMC (Msp130) имунолошки дамки на врвот на раката. Јадра извалкани со DAPI (сина). ДА, допамин ДЦ, допа декарбоксилаза. Скала лента ( a - f ) 50 μm, ( g - j ) 10 μm.
Експерименти за регулирање на надолу на гените (Слика 3) и нарушување на лековите (Слика 2 и 3) кои имаат за цел две независни точки на сигналната патека, како и временските и просторни модели на изразување на биосинтетичките ензими на допамин и допамин (слика 4) идентификувајте го допаминот како клучен сигнал што посредува во фенотипскиот одговор на достапноста на храната. Без сигнал за допамин, пластичноста до должината на раката се губи. Така, насоката на фенотипната пластичност е јасна: Кратките краци се индуцираат во висока густина на храна кога сигналите на допамин го инхибираат истегнувањето на скелетот и со тоа го промовираат структурниот раст.
Последици за ингестија и складирање на мајки липиди
Покажувајќи дека вклучувањето на сигнализацијата на допамин е насочено кон намалување на големината на краците на храната, ние исто така успеавме вештачки да ја манипулираме големината на структурата на храната за да го одредиме адаптивниот капацитет. Ние ги тестиравме функционалните последици за хранење и потрошувачка на енергија на фармацевтски различна големина на уредот за хранење. Овој метод беше поволен во однос на различните концентрации на алги, бидејќи ларвите на морските ежови можат да содржат егзогено растворен органски материјал 20, 21 што може да ја промени нивната метаболичка состојба, иако сè уште не се хранат.
Претходните студии покажаа дека големината на апаратот за хранење корелира добро со максималната стапка на дозвола за храна во текот на времето на развој 13, 22 и помеѓу различните видови 23 ларви на Ехинодерм. Разликите во големината помеѓу видовите или фазите на развој (на пример, 4-рака наспроти 8-рака Echinoplutei) се поголеми отколку што забележавме овде во една единствена развојна фаза во еден вид. За да утврдиме дали релативно малите промени во структурата на хранење можат значително да влијаат на стапките на зафаќање на алгите, ние фармацевтски манипулиравме со големината на структурата на хранење и потоа им дозволивме на ларвите да се хранат со суспензија на мимики на алги. Варијацијата во должината на посторската рака значително корелираше со Р.
( а ) Регресија на стапката на клиренс на должината на постоперативната рака по 5 дена во повторени обиди (кругови, триаголници и дијаманти) на 1.500 бисери на мл. И двете варијабли беа нормализирани во однос на набудуваните максимуми. Соединета регресија на моделот I, R 2 = 0, 197, β 1 = 0, 866, P 2 = 0, 877, β 1 = 0, 287 0, 14 (95% CI), n = 6-ти шипки за грешки ± сем
дискусија
Се сметаше дека одговорот на хранење на ларвите на морските ежови, како и многу карактеристики предизвикани од плен, е навредлив и ја зголемува потрагата по предатори 2, 15. Спротивно на тоа, нашите податоци покажуваат дека молекуларниот механизам всушност ја намалува големината на структурата на хранење кога се откриваат алги. Сигнализацијата на допамин предизвикана од алги ја потиснува стандардната развојна програма што се користи при претходна исхрана на ларвите за производство на пократки краци со помал потенцијал за хранење.
Со цел да се одржи фенотипната пластичност, фенотипските промени треба да ја зголемат соодветноста за дадената средина. Покажуваме дека фенотипот со долго вооружување ја максимизира кондицијата кога храната е оскудна, со зголемување на потенцијалот за стекнување храна на штета на мајчините липиди. Додека фенотипот со кратки вооружувања ја максимизира кондицијата кога храната е во изобилство со зачувување на мајчините липиди на штета на максималниот потенцијал за снабдување со храна. Може да има дополнителни компромиси за фитнес, на пример помеѓу должината на раката и големината на желудникот 26 и/или перформансите на пливање 27, кои се поврзани со овој развојен одговор.
Можноста за доделување на складишта на мајчинска енергија за други цели може да има значителни последици за преживување и успех во работата во неколку фази од животот преку латентни ефекти 28, 29, 30. На пример, со зголемување на нивната распределба за развој на малолетници, ларвите може да бидат во можност да го скратат должината на времето кога се изложени на предатори во планктоните, или може да има зголемување на квалитетот на малолетниците 29,30. Бидејќи S. purpuratus има висока стапка на смртност по населбата со ретки успешни настани за регрутирање 31, 32, состојбата при населување може да биде важен фактор што ја контролира динамиката на популации на бентосни морски еж, што има импликации на ниво на заедница 33, 34. Како што се зголемува фреквенцијата или сериозноста на несовпаѓањето на фреквенцијата на ларвата и достапноста на храната, намалувањето на фреквенцијата на алгите за време на фазата пред-хранење доведува до зголемена инциденца на ларви со долг вооружување и губење на какви било придобивки од ларвите со кратко вооружување, како што е прераспределба на продавниците за енергија кај мајките.
Нашите податоци ја демонстрираат адаптивната употреба на допаминските сигнали за брзо менување на развојот на структурите за добиточна храна во пресрет на храната. Само преку механистичко разбирање, оваа форма предизвикана од плен може да се смести во соодветниот еколошки и еволутивен контекст. Различни организми, од црви до луѓе, користат допамин сигнализација 35, 36 преку рецептори на допамин тип Д 2, особено 37, 38, за да предвидат потрошувачка на храна. Кај C. elegans 35, 38, инсекти 39, 40, возрасни морски ежови 41 и цицачи, вклучително и луѓе 36, допамин сигналот го менува однесувањето во пресрет на голтањето, додека ларвите на морските ежови го менуваат својот развој и облик пред голтањето. Оттука, сигнализацијата на допамин, која е вклучена во регулирањето на развојот на ларвата, може да претставува ко-опција или промена од високо конзервираната употреба на допамин сигнализација при посредничко однесување во пресрет на храна.
Методи
Култура на ембриони и ларви
Возрасни морски ежови, Strongylocentrotus purpuratus, од културен абалон и лабораторија за морски безрбетници на Поинт Лома, CalTech, се одржуваа во морска вода на 10 ° С. Гаметите беа собрани со интрацелоломски инјекции од 0,55 M KCl. Ембрионите се одгледуваа со употреба на стандардни методи со густина од 1-5 ембриони на мл во вештачка морска вода (ASW) на 15 ° C со или без алги (5.000 клетки на ml Dunaliella sp.) .
Квантификација на должината на скелетот
Должините на постерската рака и шипка на телото (секоја n ≥ 20) беа утврдени од случаен примерок што беше земен непосредно пред почетокот на хранењето на 5 дена од денот, со исклучок на ембриони на кои им беше инјектиран морфолино и беа земени по 4 дена на ден, за да се обезбеди ова распаѓање на морфолиното во синтезата на ТХ протеини сепак беше ефективно. За позиционирање на скелетните елементи во иста рамнина, ларвите беа исцедени на слајдовите на микроскопот, а потоа беа снимени со превртен микроскоп Zeiss Axiovert 200 M на 20 × под диференцијален контраст на заклучок, при што лесно можат да се идентификуваат дворефренгивните скелетни елементи. Должините на скелетот беа измерени од дигиталните слики со софтверот AxioVision (Carl Zeiss MicroImaging). Во некои случаи (42, амисулприд, високо селективен антагонист на рецептори за допамин Д 2/Д 3 и хидрохлорид на α-метил-ДЛ-тирозин метил естер, селективен инхибитор, нарушен со ТХ 44, директно преку разредување во културниот медиум (ASW) администриран на ларви во полн брат и сестра во доцната фаза на гаструла (48-52 hpf) освен ако не е поинаку наведено во текстот Фармацевтски експерименти биле извршени во дупликат со различни женски-машки парови.
Микроинјекции
Оплодените јајца беа надополнети со филтрирани раствори кои содржат 20% глицерин и родамин-декстран без морфолинос (контрола на глицерин) со 0,4 mM TH MASO1 или со 0,15 mM TH MASO2 со употреба на Eppendorf Femtojet-Injectman NI2 микроманипулатор, Беше поврзан превртен микроскоп на флуоресценција Leica, микроинјектиран во (Уп. 45). Инјекциите на TH MASO1 беа реплицирани со два различни парови од женско-машки пол. Глицерол и неинјектирани ембриони беа споредувани и не беа забележани значителни промени во должината на скелетот, ТИ имунитетното боење или одговор на алгите. Затоа, некои подоцнежни експерименти користеле неинјектирани ембриони како контроли. Блокирањето на преводот TH MASO1 е развиено врз основа на предвидениот TH (GLEAN 00836) 5'UTR, што е потврдено од RACE. TH MASO1: 5'-GCGTCCTGCTGTAGAAGATACTTGA-3 '. TH MASO2 ја насочи границата на интронот 8/егзон 9 за да го наруши ензимот 46 каталитички домен. TH MASO2: 5'-GCCTACGATGAACAAGAACAAATGT-3 '.
Статистички анализи за нарушувања на допаминот
Одзивот на дозата на должината на посторалната рака на третманот со квинпирол беше оценет со употреба на еднонасочна анализа на варијанса (ANOVA) проследено со поправени пар-споредби со контролата на Бонферони за да се утврди дали промената е значајна од контролата. Одговорот на алгите беше оценет кај фармацевтските и Т.Х. MASO1 нарушувања со тросочна ANOVA во која третманот со нарушувања, третманот со алги (наспроти без алги) и експерименталната репликација беа специфицирани ефекти и средната квадратна грешка како именител на односот f 47 . Бидејќи сите експерименти покажаа значителна (Р> 0,05) интеракција помеѓу пореметувањето и третманот со алги за должината на посторалната рака, беа извршени последователни споредби поправени од Бонферони за да се утврди дали промената предизвикана од алгите е значајна. ТХ MASO2 не беше реплициран и така оценет со двонападни т-тестови на Студент. Сите статистички проценки беа извршени во SYSTAT v10 со излез до три децимални места, затоа се дадени точни вредности на P за P> 0,001.
Имунобоење и флуоресценција in situ хибридизација
Обид за хранење
Ние третиравме ларви со полубратимци од три жени со ASW (контрола), DRD2 агонист (квинпирол) и DRD2 антагонист (амисулприд) со цел да го зголемиме опсегот на големината на структурите за хранење. Ларвите од секој од овие третмани беа комбинирани во три реплицирани култури, пренесени во ASW за 4 часа, а потоа беа третирани со нежно возбудена суспензија на имитациони алги, 10 μm. m Polybead микросфери (Polysciences, Inc) обложени со BSA на 1.500 или 4.000, нахранети зрнца на ml, 45 мин. Бројот на подигнати монистра и должината на скелетот се измерени за најмалку 30 ларви од секоја реплика како погоре. Немаше значајна разлика помеѓу примероците што се повторуваа нахранети со 1.500 зрнца на ml (двофакторна ANOVA, двоопадна P = 0.950, SYSTAT v.10), така што репликите беа обединети и анализирани со примена на регресијата на моделот I.
Липидни анализи
Дупликатните култури, секоја составена од полу-браќа и сестри од три жени, се одгледуваа во нежно промешани 500 мл чаши во инкубатор на 15 ° С. На почетокот на продолжувањето на раката (
Нормализираните просечни вредности на должината на раката на постот и триглицерид беа постигнати со користење на модел II геометриска средна регресија 52 за да се даде предвид грешката поврзана со обете варијабли. Должината на постералната рака беше нормализирана до максимум. Концентрацијата на триглицерид беше нормализирана до почетната концентрација во оплодените јајца (ден 0, пред расцепување). Третманите во рамките на реплицирана култура ги имаа истите почетни концентрации на триглицериди, овозможувајќи директни споредби помеѓу третманите. Бидејќи немаше интеракција со културите (двофакторна ANOVA, двострана P = 0,478, SYSTAT v.10), двете култури беа обединети за регресија.
Понатамошна информација
PDF-датотеки
Понатамошна информација
Дополнителни бројки S1-S4 и дополнителни табели S1-S3
Забелешки
Со поднесување коментар, вие се согласувате со нашите услови за користење и упатствата за заедницата. Ако најдете нешто навредливо или што не е во согласност со нашите услови или упатства, означете го како несоодветно.