Ефектот на хранливата синергија врз човечките клетки на остеосарком U-2 ОС; Д-р
М. Вахид Роуми, Вадим Иванов, Матијас Рат и Александра НиџвијецкиСоодветен автор: д-р Александра Нидцвиецки.
1260 Диск Меморекс
Санта Клара, Калифорнија, 94050 САД
Телефон: 408-567-5564
Факс: 408-986-9403
Е-пошта: [email protected]
кратка верзија
Вовед:
Тековната терапија за примарни малигни тумори на коските или меките ткива, кои произлегуваат од мезенхимални клетки кои формираат коски, има слаба прогноза, особено поради зголемениот ризик дека хемотерапија ќе развие други карциноми. Затоа се неопходни нови стратегии за третман кои се ефикасни без токсични несакани ефекти. Ин витро студијата спроведена неодамна во нашата лабораторија покажа дека Нутриент синергија (НС), единствена формулација составена од лизин, пролин, аргинин, аскорбинска киселина и епигалокатехин галат, има хемопревентивно дејство врз разни видови на карцином. НС демонстрираше потенцијална синергетска антиканцерогена активност со инхибиција на металопротеинази во матрицата, клучни ензими против инвазија и метастази.
Цел:
Ние го испитавме влијанието на хранливата синергија врз човечките клетки на остеосарком U-2 Os со мерење на цитотоксичност, прилагодување на матрикс металопротеиназите (ММП): ММП-2 и ММП-9 и инвазивниот потенцијал.
Методи и супстанции:
Човечки клетки на остеосаркома U-2 Os беа култивирани во МекКлој медиум, кој беше третиран со 10% серум од плод на говеда и со антибиотички плочи од 24 бунари за култура. На сливот, клетките беа поставени на 0, 10, 50, 100, 500 и 1000 m g/ml синергија на хранливи материи, секоја доза во три примероци. Цитотоксичноста е оценета според бројот на клетки измерени со МТТ тест по 24 часа, ММП изразување со желатиназа зимографија во контролниот медиум и инвазија од Матригел.
Резултати:
Хранливите синергии не беа токсични со 10 mg/ml и моменталната доза на токсичност беше максимум 60% над контролното ниво од 1000 mg/ml. Зимографијата покажа зависна од дозата инхибиција на излезот на ММП-2 и ММП-9 преку синергија на хранливи материи со практична тотална инхибиција во концентрација од 500 mg/ml. Инвазијата на клетките на остеосарком од страна на Матригел значително се намали на 50 mg/ml (74%) и беше целосно инхибирана во концентрација од 100 mg/ml.
Заклучок:
Нашите резултати покажуваат дека хранливата синергија е одличен кандидат за терапевтска употреба во третманот на остеосарком поради инхибиција на изразување на ММП, ангологенеза и инвазија - сите важни и ветувачки параметри за скрининг на карцином.
вовед
Остеосарком, примарен малиген тумор на коските или мекото ткиво што произлегува од мезенхималните клетки кои ги формираат коските, генерално се развива во дисталниот бедрената коска (бутната коска), проксималната (кон трупот) тибија (коска на коската), проксималниот хумерус (хумерусот) и дисталниот радиус (зборуваше). Класичниот остеосарком покажува агресивен брз раст со висок ризик од локални секундарни метастази и рани метастази во белите дробови. Тоа е најчестиот карцином на коски и шести најчест карцином во детството што обично се развива кај адолесценти кои доживуваат бран на раст. Почеста е кај момчињата отколку кај девојчињата. Повеќето остеосаркоми произлегуваат од ненаследни дефекти во ДНК на растечките коскени клетки. Бидејќи овие грешки се случуваат случајно и непредвидливо за време на растот на коските, во моментов не е можно ефикасно да се спречи овој вид рак (1).
Тековните терапии за остеосарком се состојат од хирургија (ампутација или операција за спасување на екстремитетите) и хемотерапија. Овие терапии се поврзани со лоша прогноза, особено поради високоинвазивната природа на овој карцином и зголемениот ризик од метастази и развој на други карциноми од хемотерапија. Од 31 пробен пациент со дијагностициран локализиран остеосарком (2) и кој бил третиран со конвенционална хемотерапија (високи дози на метотрексат и спас на леуковарин кај 3 пациенти и интра-артериски цисплатин кај 28 пациенти) во Центарот за карцином Андерсон, само 3 пациенти немале локален рецидив или Метастази во белите дробови во наредниот период од 225+ месеци. Несакани ефекти на хемотерапија, исто така, вклучуваат анемија, абнормално крварење, зголемен ризик од инфекција како резултат на уништување на коскената срцевина, оштетување на црниот дроб и бубрезите, неправилности во менструалниот цистит, циститис и крв во урината, остеосарком на кожата и остеосарком кои метастазираат во белите дробови, мозокот или другите коски (1).
Еден од клучните механизми со кои клетките на ракот се шират и метастазираат во телото, исто така, вклучува ензимско уништување на сврзното ткиво. Терапевтски обиди да се ограничи овој процес со специфични лекови не биле успешни и во моментов нема други средства за ограничување на метастазите во карцином. Со децении, стандардната терапија за остеосарком се состои од хирургија и хемотерапија, чија цел е уништување на клетките на ракот, но не насочување кон метастазите. Зрачењето и хемотерапијата не само што се неефикасни во постигнувањето на лек, туку ги напаѓаат сите клетки неселективно, предизвикувајќи оштетување на клетките, уништувајќи го сврзното ткиво и со тоа овозможувајќи метастази во рак. Очигледно, постои потреба за безбедна и ефективна природна процедура што може да го ограничи процесот на метастаза на рак.
Сите видови на клетки на ракот формираат тумори преку ослабување на екстрацелуларната матрица (ECM) со помош на разни металопротеинази во матрицата (ММП). Активноста на овие ензими оди рака под рака со агресивноста на растот на туморот и интрузивноста на ракот. Во 1992 година, Рат и Поулинг (3) утврдија дека хранливите материи како што се лизин и аскорбинска киселина можат да дејствуваат како природни инхибитори на ECM протоанализата и дека имаат потенцијал да влијаат на растот и проширувањето на туморите. Овие хранливи материи можат да ги извршуваат своите антитуморни ефекти преку разни механизми. Овие вклучуваат инхибиција на ММП и зајакнување на сврзното ткиво што ги опкружува клетките на ракот (ефект на капсулација на тумор). Во претходната студија, го демонстриравме овој антипролиферативен и антиинвазивен потенцијал на лизин, аскорбинска киселина, пролин и епигалокатехин галат (ECGC) на карцином на дојка кај луѓе (MDA-MB 231), клетки на карцином на дебело црево (дебело црево) (HCT 115) и типови на меланом клетки ( A2058) (4). Хранливата синергија исто така го потисна растот на овие тумори без негативни ефекти кај голи глувци. Во тековната студија, го испитавме антитуморен потенцијал на хранлива синергија ин витро на типови клетки на човечки остеосаркоми U-2 ОС.
Поставување на цел
Ние го испитавме ефектот на хранлива синергија (НС) врз човечките клетки на остеосарком U-2 ОС со мерење на цитотоксичност и регулирање на матрикс металопротеиназите (ММП), ММП-2 и ММП9, како и инвазивниот потенцијал.
Методи и супстанции
Клеточни култури
Човечки остеосаркоми U-2 OS клетки се добиени од ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) и одгледувани во медиум на МекКој дополнет со 10% серум од говеда кај фетусот, пеницилин (100 U/ml) и стрептомицин (100 mg/ml) ) во плочи со култура од 24 бунари (Костар, Кембриџ, м-р). Клетките се инкубираат со 1 ml медиум на 37 ° C во инкубатор за ткивна култура (инкубатор) со 95% воздух и 5% CO 2 остануваат исти. На сливот, клетките биле третирани со хранлива синергија, растворени во медиум и тестирани на 0, 10, 100 и 1000 mM, секоја доза во три примероци. Плочите потоа беа ставени назад во инкубаторот. Цитотоксичноста на реагенсите беше проверена по следната 24-часовна инкубација.
МТТ тест
Одржливост/цитотоксичност е оценета по пролиферацијата на клетките со тест МТТ и во серум-медиум и во медиум дополнет со 10% PBS. Без серумскиот медиум од клетките беше отстранет и тестиран за ММП. Клетките во бунарите беа измиени со солен раствор на фосфат (PBS), и на секој бунар беа додадени 500 ml MTT (Sigma # M-2128) 5 mg/ml во PBS. Плочите за култура беа инкубирани на 37 ° C за дополнителни 2 часа. Медиумот беше внимателно аспириран и 1 ml ДМСО (диметил сулфоксид) е додаден на секој од нив за да се растворат сините кристали на формазан. Оптичката густина е измерена на 590n. ОД 550 од решението ДМСО во секоја бунар беше прегледано директно со спектрофотометарот Шимаџу BioSpec 1501. ОД 590 од растворот ДМСО во секоја бунар се сметаше за пропорционален на бројот на клетки. ОД 590 на контролата (третман без додавање) се сметаше за 100%.
Зимографија на желатиназа
Изразот на ММП во зададениот медиум беше определен со зимографија на желатиназа. Ymелатиназа зимографија беше визуелизирана во 10% гел полиакриламид (Био-Рад, Херкулес, Калифорнија) во присуство на 0,1% гел. Средството за култура (20 ml) беше натоварено и SDS-PAGE беше прикажан со пуфер Tris-глицин. По електрофореза, гелите се мијат со 5% тритон X-100 30 минути. По миењето, гелите се инкубираа 24 часа на 37 ° C, во присуство на 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl 2, 5 mM ZnCl 2, pH 7,5 и 30 минути со Coomessie blue R 0,5 % обоени и повторно дамки. Стандардите на протеините беа постојано следени и беше утврдена приближната молекуларна тежина.
Студии за инвазија на Матригел
Студиите за инвазија беа извршени со примена на инсерти од Матригел (Бектон Дикинсон) на плочите со 24 бунари. Клетките на остеосаркомот суспендирани во раствор натоварен со хранливи материи, како што е наведено во дизајнот на експериментот, беа ставени во вметнувањето на бунарите. И медиумот на влошката и во садовите ги прими истите адитиви. Плочите со инсертите потоа беа инкубирани во културен инкубатор балансиран со 95% воздух и 5% CO 2 за 24 часа. По инкубацијата, медиумите беа извадени од бунарите. Клетките на горната површина на влошките беа внимателно избришани со памучни брисеви. Клетките кои продирале во мембраната Митрагел и мигрирале на долната површина на матригел, биле обоени со хематоксилин и еозин и оптички се броеле под микроскоп.
Табела 1 - Состав на хранлива синергија
Хранлив раствор на синергија, составен според пропорциите прикажани подолу, се раствори во медиум, како што е наведено во дизајнот на експериментот за лекување на клетките.
Статистичка анализа
Резултатите беа дадени како просечни вредности + SE за групи. Податоците беа анализирани со независен тест „Т“.