Голема реконструкција на дефекти со нова хибридна рамка изработена од поли
предмети
апстрактен
вовед
Дефектите на коските во критична големина се вообичаено клиничко нарушување, генерално предизвикано од траума, коскено заболување или ресекција на тумор 1. Како резултат на загубата на коските не може да се поправи физиолошки и обично се потребни големи количини на регенерација на коските 2. Коскените графтови, како што се автографтите и алографтите, се широко користени за индукција и зголемување на коските кај големи коскени дефекти 3. Сепак, овие коскени графтови имаат некои ограничувања што ги прават синтетичките замени на коскениот графт атрактивна алтернатива 4, 5 .
Резултати
Карактеризација на рамките PLLA/nHA/CM-AL
Морфологија и порозност на рамката
Морфолошките карактеристики на скелетите беа визуелизирани со светлосна микроскопија и SEM како што е прикажано на Сл. Пресечната анализа на рамките под светлосна микроскопија покажа дека фотошките зони и CH/nHA-AL (кафеава) се рамномерно распоредени во рамките (Слика 1А). Под SEM, рамките покажаа хомогено поврзана порозна структура со дијаметар на порите од 150-250 μm. Морфологијата на скелетите беше многу различна помеѓу двата скела (PLLA/nHA и CM-AL), со CH/nHA-AL делумно вградени во скелетите CM-AL (1А).
Карактеристики на скелетите CM-AL кои содржат различни концентрации на CH/nHA-AL. ( А. ) Морфологија на CM-ALs (0%), CM-ALs (10%) и CM-ALs (20%) рамки под светлосна микроскопија (LM) и електронска микроскопија за скенирање (SEM); ( Б. ) Порозност на CM-AL рамки со различна содржина на CH/nHA-AL; ( Ц. ) Јачина на притисок и модул на CM-AL рамките со различна содржина на CM-AL; ( Д. ) Ин витро испитување на ослободување на лекови на скелиња CM-AL до 25 дена користејќи скеле CH/nHA-AL и PLLA/nHA/AL како контроли. Црната стрелка ја означува PLLA/nHA матрицата додека белата стрелка ги означува CH/nHA-AL микросферите. * стр
Ин-витро деградација на CM-AL рамките со различна содржина на CH/nHA-AL во текот на 12-неделното набудување. ( А. ) Морфолошки промени во скелетите забележани под СЕМ; ( Б. ) pH вредност на деградациониот медиум на подготвеното скеле со зголемување на времето на инкубација; ( Ц. ) Губење на масата на скелето за време на периодот на демонтирање. Белата стрелка означува CH/nHA-AL микросфери. * стр
Ин витро цитокомпатибилност на скелетите CM-ALs. ( А. ) Клеточна морфологија и адхезија на зајачки ASC на скеле под СЕМ; ( Б. ) Анализа на цитотоксичност на ASC преживеана во спуштање на скеле со употреба на MTT анализа; ( Ц. ) Алкален фосфат (ALP) активност на ASC во течноста за лужење на скелето; ( Д. ) Синтезата на минерализираната матрица беше анализирана за таложење на калциум со боење со црвена ализарин. Белата стрелка означува CH/nHA-AL микросфери. * стр # стр
Х-зраци анализа на регенерација на коските во различни периоди по имплантацијата. ( А. ) Репрезентативни радиографии на регенерација на коските во различно време. Имаше ново формирање на коски во контролната група, но дефектот на коските не беше поправен; Во групата за автографт, автологниот ортотопичен графт овозможи целосно заздравување на дефектите на радиусот за време на 8-неделното следење; Во групата на CM-ALs (0%) импланти, имаше очигледно ново формирање коска во 8-та недела. Ретко беа забележани линиите на фрактури на коските, додека не беше пронајдено вкрстено поврзување на шуплините на коскената срцевина. Во ЦМ-АЛ (10%) имплантирана група, коскените дефекти беа залечени со формирање на нови коски во период од 4-8 недели. ( Б. Полуквантитативната анализа покажа значително формирање на нови коски кај ЦМ-АЛ (10%) - имплантирана група во споредба со ЦМ-АЛ (0%) - имплантирана група, а податоците се зголемуваат со текот на времето. * стр
Хистолошка анализа на регенерација на коските и деградација на скелето во различни периоди по имплантацијата. ( А. ) HE боење кое покажува мала количина на новоформирани трабекули по 2 недели во двете ЦМ-АЛ (0%) и ЦМ-АЛ (10%) групи. За 4 и 8 недела беа претставени трабекули од груби коски и групирани со јасно видлива васкуларна структура. Дефектот исполнет со влакнести ткива сè уште беше видлив во групата CM-AL (0%), додека беше помалку видлив во групата CM-AL (10%). ( Б. ) Квантитативната анализа покажа зголемување на областа на нови коски со вградените ЦМ-АЛ и зголемување на деновите. Белите стрели означуваат области на формирање на нови коски, додека црните стрели ја означуваат рамката (зголемување: × 40). * стр
Боењето на Масон покажа постепено созревање на новоформираната коска и во двете групи. Новоформираната коска беше обоена во сина сина боја (како што покажува белата стрела) на 2-та недела, а сината област постепено се собираше како што созреваше коската на 8-та недела, што укажува на тоа дека остеогенезата започнала во двете групи веќе во 2-та недела, сепак, процесот на остеогенеза траеше подолго во групата CM-ALs (10%) отколку во групата CM-ALs (0%) (зголемување: 40 ×).
дискусија
Анализата на ин витро деградација покажа зголемена деградација на скелетите CM-AL со зголемена содржина на CH/nHA-AL и немаше значајна разлика во деградација помеѓу скелетите CM-AL (10%) и контролата на PLLA/nHA. Варијацијата на pH за време на ин витро деградацијата на порозните скелиња CM-AL беше помала од онаа на скелетите PLLA/nHA, што укажува на деградација и на PLLA матрицата и на CM. Во меѓувреме, односот на слабеење во скелетите CM-AL беше значително зголемен, додека механичките својства беа значително помали. Овие резултати беа во согласност со претходната студија, која покажа дека губењето на тежината на композитите засновани на PLLA се зголеми со зголемената доза на CM, и ова се припишува на преференцијалното растворање на компонентата на хитозан во композитите 41. Предложено е брза деградација на воведените КО да придонесе за губење на тежината на скелетите во раната фаза 37. Генерално, нашите резултати покажаа доказ дека скелетите PLLA/nHA со 10% CH/nHA-AL покажаа преференцијални својства, додека зголемувањето на содржината на CH/nHA-AL на 20% предизвика негативен ефект. Затоа, скелетите PLLA/nHA со 10% CH/nHA-AL беа користени во понатамошните студии.
Сепак, оваа студија има и некои ограничувања. Молибденската сина колориметрија беше примарно искористена за да се утврди концентрацијата на АЛ врз основа на фосфатниот анјон во вода. Иако методот се покажа како репродуктивен, точен и погоден за одредување на AL 33, 48. Сепак, наместо PBS се користеше дестилирана вода, што симулира постојана pH вредност на телесната течност, бидејќи голема количина на фосфат од PBS може да се меша со одредувањето на AL. Затоа, други методи кои можат подобро да ја симулираат состојбата на телесната течност може да се земат предвид за одредување на АЛ во нашата идна работа.
Како заклучок, микросферите во капсулирање на AL/CH/nHA беа успешно вметнати во скеле базирани на PLLA/nHA и беше развиен систем за испорака базиран на микросфера за испорака на АЛ и инженеринг на коскеното ткиво. Скелетите CM-AL (10%) покажаа поодржливо ослободување на лекот и споредливи својства на механичка и деградација. Остеогената диференцијација на ASC исто така беше подобрена, што беше потврдено со значително зголемена активност на ALP и таложење на калциум. Ин виво студиите покажаа одлично заздравување на коските од скелиња CM-ALs (10%), споредливо со автографтите. Резултатите од оваа студија сугерираат ветувачка примена на скелиња CM-ALs (10%) за испорака на лекови и инженеринг на коскеното ткиво.
материјал и методи
Производство на PLLA
PLLA се направени со полимеризација на лактидот што го отвора прстенот. Накратко, Л-лактиден мономер (90%, Jiangxi Wuzangye Biochemical Industry Co., Ltd., Shanghai, China) беше дехидриран на 140-150 ° C за 4 до 5 часа, проследено со дехидрираност на декомпресија на 2,5 до 8,0 kPa и 170 ° C за 6-8 часа. Производите беа деполимеризирани во лактид во присуство на станозен октотат (0,27 kPa, 37 ° C). Лактидот беше прочистен со повторна кристализација со употреба на етил ацетат како растворувач. Полимеризацијата на отворот на прстенот беше извршена за да се произведе PLLA во присуство на лактид и октоат од калај како иницијатор и катализатор (8000: 1). PLLA-кополимерот се карактеризира со хроматографија со гел-пермеација (ГПЦ) и инфрацрвена спектроскопија со трансформација на Фурие, како што е претходно опишано 49.
Производство на порозни CM-AL рамки
Шематски приказ на производството на скелиња PLLA/nHA/CM-AL за регенерација на коските кај зајачки модел со големи сегментални коскени дефекти.
Карактеризација на рамките PLLA/nHA/CM-AL
Карактеристики на морфологијата и порозноста
Морфологијата на скелетите PLLA/nHA/CM-AL беше визуелизирана со светлосна микроскопија (Олимп У-РФЛ-Т, Токио, Јапонија) и електронска микроскопија за скенирање (СЕМ, Нова НаноСЕМ230, САД). Порозноста на скелетите се мери според принципот на Архимед, како што беше претходно опишано 51. На кратко, рамките беа ставени во мерен цилиндар кој беше исполнет со одредена количина етанол (V1). Беа снимени вкупниот волумен по потопувањето во скелето (V2) и волуменот на етанол што остана во цилиндерот (V3) по отстранувањето на скелето. Порозноста потоа се утврди со користење на следната равенка:
Механички својства
Рамките со должина од 20 ± 0,7 mm и ширина од 7 ± 0,5 mm беа произведени и сушени во вакуо 24 часа. Механичките својства беа измерени со употреба на универзална машина за механичко испитување Instron 1121 на собна температура со стапка на оптоварување од 1,0 mm/min и механичка деформација од 2 mm. Модулот за компресија е пресметан со употреба на динамички модул на тестер за еластичност DTM-II (Xiangyi Instruments Co., Ltd., Xiangyi, Кина). Три примероци беа тестирани за секој примерок.
Ин витро испорака на лекови
Ин витро ослободувањето на лекот беше измерено според нашиот претходен метод со некои модификации 33. Накратко, секое скеле беше ставено во вреќа за дијализа, потопена во дестилирана вода (40 ml) и се тресеше 25 дена на 37 ° C и брзина од 45 вртежи во минута. Супернатантот (2 ml) се собираше секој ден и се мереше со молибден-сина колориметриска анализа.
Деградација на ин витро
Примероците од правоаголни скелиња беа потопени во раствор на фосфатен пуфер (PBS) и беа следени со варијација на pH и односот на слабеење. PH се мереше еднаш неделно, 16 недели. Губењето на тежината на скелетите беше забележано на секои 4 недели по вакуумското сушење за време на периодот на расклопување. Направени се три примероци од секое скеле за секоја временска точка.
Тест за биокомпатибилност in vitro
Анализа на морфологија на клетките и адхезија
Скелетите беа култивирани заедно со матични клетки добиени од зајачка маст (ASCs, Cyagen Biosciences Inc., Гуангжу, Кина) за анализа на клеточната морфологија и адхезија. Скелетите беа исечени на мали парчиња (7мм х 7мм х 1мм) и стерилизирани со помош на стерилизација со ниска температура во плазмата. ASC (1 × 10 4 клетки/ml, 100 μl) беа засеани на скелетите и се инкубираа 2 часа во инкубатор на 37 ° C за да се овозможи прицврстување на клетките. Потоа се додадоа 2 ml од Дулбеко модифициран орел медиум (ДМЕМ) дополнет со 10% серум од фетален говеда за да се хидрира. На 2 и 5 дена од културата, скелетите засадени со клетки беа отстранети и внимателно измиени три пати со PBS. Клетките на скелетите потоа беа имобилизирани со 4% формалдехид и осмиум тетроксид за 15-30 минути на 4 ° C и внимателно измиени 3 пати со PBS. Примероците потоа беа дехидрирани последователно со серија етанол (50, 70, 90, 95 и 100%) двапати по 10 минути секој пат. На примероците им беше дозволено да се исушат во критична точка и обложени со злато за СЕМ анализа на клеточна морфологија и адхезија.
Тест за ин витро цитотоксичност
Плочите на скеле од 100 мг (14 плочи, 7 мм × 7 мм × 1 мм/плоча) беа стерилизирани и потопени во 20 ml медиум на 4 ° C за 48 часа. АСЦ-зајаци (5 × 104 клетки/мл, 100 µl) беа засадени во плочи со 96 бунари и се култивираа во инкубатор на 37 ° C 48 часа, а потоа медиумот се освежи. На секој бунар е додаден раствор на MTT (1 mg/ml, 100 μl, Sigma-Aldrich) на 1, 3 и 5 дена и се инкубира 4 часа на 37 ° C. По отстранувањето на суперинатантите, 150 .mu. l Додаден диметил сулфоксид (ДМСО, Сигма-Олдрич) за растворање на сините кристали на формазан. Апсорпцијата е измерена на 490 nm со читач на ELISA (Bio-Tek Instruments, Inc., Highland Park, VT, USA).
Ин витро остеогена диференцијација
Остеогениот ефект на скелетите PLLA/nHA/CM-AL in vitro беше анализиран со анализа на активност на алкална фосфатаза (ALP) и со боење со црвена ализарин. АСЦ-зајаци (5 x 104 клетки/ml, 120 μl/бунар) беа засадени во плоча со 12 бунари што содржеа извлечени течности од скелиња со или без остеогена средина (OGM, DMEM, 10% FBS, 100 nmol/l дексаметазон). 0,05 mmol/l аскорбинска киселина и 10 mmol/l & bgr; -Глицерофосфат). АЛП активност се мери на 7 и 14 дена како што е претходно опишано 31. За боење со ализарин црвено, медиумот се менуваше на секои 3 дена. Клетките се добиени на 7 и 14 дена и фиксирани во 4% формалдехид 15 минути. По двапати миење со PBS, примероците беа третирани со ализарин црвена боја (0,5 ml, 40 mmol/l, pH = 4,1) за 25 мин. Сликите потоа беа направени под превртен оптички микроскоп (Никон, Токио, Јапонија). Процентите на позитивни клетки се пресметани од најмалку 3 случајно избрани полиња.
Регенерација на коските in vivo
Статистичка анализа
Податоците беа изразени како средна ± стандардна девијација (SD). Експериментите беа извршени во три примероци. Статистичките споредби беа направени со студентски тест или еднонасочна анализа на варијанса (ANOVA), како што е соодветно. P вредностите помалку од 0,05 се сметаа за статистички значајни.
благодарноста
Оваа работа беше поддржана од Националната фондација за природни науки на Кина (грант бр. 81371934, бр. 81501860 и бр. 31470948) и делумно финансирана од кинескиот совет за стипендии (грант бр. 201506370173).
Забелешки
Со поднесување коментар, вие се согласувате со нашите услови за користење и упатствата за заедницата. Ако најдете нешто навредливо или што не е во согласност со нашите услови или упатства, означете го како несоодветно.