Идентификување на фактори на транскрипција Олиг2 геномски места за врзување во акутно прочистен PDGFR; Клетки од
Резиме
Овде претставуваме протокол дизајниран за анализа на врзувањето на геномот на транскрипциониот фактор олигодендроцит 2 (Олиг2) во акутно прочистените мозочни олигодендроцитни прогениторни клетки (ОПЦ) со изведување на имунопреципитација со низок клеточен хроматин (чип), подготовка на библиотека, секвенционирање со висока пропусна моќ и биоинформатичка анализа на податоците.
Апстракт
Вовед
Важно е да се проучи врзувањето на ДНК за протеините (или протеинскиот комплекс) и епигенетските маркери за да се изградат транскриптивни регулаторни мрежи во различни биолошки процеси. Особено, врските помеѓу факторите на транскрипција и геномската ДНК можат да играат важна улога во регулацијата на генот, диференцијацијата на клетките и развојот на ткивото. Тоа е моќна алатка за проучување на транскрипциската регулација и епигенетските механизми на имунопреципитација на хромат (ChIP). Поради брзиот напредок во технологијата за секвенционирање на следната генерација, анализата на врзувањето на протеини-ДНК и епигенетските ознаки се користи во 1 чип поврзан со секвенционирање на ДНК со голема пропусност (ChIP-Seq). Сепак, за стандарден протокол ChIP-Seq потребни се приближно 20 милиони клетки на реакција, што ја прави оваа техника тешка за употреба кога клетката е ограничена, како што се изолирани примарни клетки и ретки клеточни популации.
Олигодендроцитни лоза клетки, вклучувајќи олигодендроцитни прогениторни клетки (ОПЦ) и олигодендроцити се широко распространети низ целиот мозок и се неопходни за развој и функционирање на мозокот. Како вид на прогениторна клетка, OPC може самостојно да се обноват и да се разликуваат. OPC не само што служат како прогенитори за олигодендроцити, туку исто така играат важна улога во ширењето на нервната сигнализација преку комуникација со други видови на мозочни клетки 2. Претходните студии сугерираат дека специфичните родови фактори на транскрипција како што се Olig2 и Sox10 3, 4 го регулираат развојот на олигодендроцитите. Овие фактори на транскрипција биле лоцирани во регионите на организаторот или засилувачот за да врзат некои клучни гени со нивниот израз додека влијаат на спецификацијата и диференцијацијата на олигодендроцитите. Сепак, тешко е да се идентификува интересот за врзување на ДНК протеините (или протеинскиот комплекс) во акутно прочистените примарни OPC со многу ограничен број на клетки.
Овој протокол опишува како систематски да се истражува геномската ДНК, имунопреципитирана од Олиг2 во прочистените OPC на глувци на ниво на геном, користејќи ја техниката ChIP-Seq. ОПЦ мозокот на глувчето беше акутно прочистен со имунопанирање и во експеримент со чип без дисеминација ин витро. Ограничен број OPC може да се добијат со имунопанирање и е доволен за стандардни експерименти со ChIP-Seq. Ова опишува протокол со низок клетка ChIP-Seq со пониски 20 илјади клетки по реакција на ChIP за фактори на транскрипција. На кратко, вкрстено поврзаните клетки беа лизирани и соникирани од ултразвучна машина која стрижеше хроматин. Намалениот хроматин беше инкубиран со Олиг2 антитела и сфери обложени со протеин А за да дојде до таложење на геномската ДНК поврзана со антителата Олиг2. По елуирање на монистра обложена со протеин А и обратно вкрстено поврзување, геномската ДНК се преципитираше со антитела Олиг2 и се прочистува со екстракција на фенол-хлороформ. Резултирачкиот производ беше квантифициран и подложен на опашка Т, преклопување и проширување на образец за сјај, додавање адаптери и арматура, избор на големина на библиотека и чекори за чистење за изградба на библиотека ChIP-Seq.
После секвенционирање, анализиран е квалитетот на суровата количина од примерокот подготвен со антитела на транскрипциониот фактор Олиг2 и контролниот примерок. Инфериорни основни парови и адаптери со прочитани фрагменти кои се исечени. Следно, исечените отчитувања беа усогласени со референтниот геном на глувчето. Геномските региони кои беа значително збогатени за читање на ЧИП беа препознаени како врвови во споредба со контролниот примерок. Значајни врвови што претставуваат можни места за врзување на факторот на транскрипција беа филтрирани и визуелизирани во прелистувачот на геном.
Методот опишан во овој протокол може главно да се користи за ChIP-Seq од други фактори на транскрипција со кој било тип на ќелија на ограничениот број.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
Целокупната потрошувачка на животни и експерименталните протоколи беа извршени според Водичот за нега и употреба на лабораториски животни и одобрен од Институционалниот комитет за биосигурност и Комитетот за благосостојба на животните на Центарот за здравство на Универзитетот во Тексас во Хјустон.
1. Прочистување на PDGFR α позитивни клетки на олигодендроцитите од мозокот на глувчето (изменето од претходно опишаните протоколи за имунопанирање 5, 6, 7)
(2) Подготовка на ниско-мобилен-чип и конструкција на библиотека за чип за секвенционирање со висока пропусна моќ
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
По првичната проценка на контролата на квалитетот, необработеното отчитување и сечење на адаптерите и заостануваните инфериорни базни основи се парцели за контрола на квалитетот на слика 4прикажано. Исечените отчитувања треба да имаат основен квалитет поголем од 30, без низа адаптери и да имаат мала удвојување (Слика 4б-Д.) Исечените отчитувања со добар квалитет ја зголемуваат вкупната стапка на усогласување. Другите параметри како содржината на GC се исто така важни и треба да се земат предвид за кастрирање.
Кога користите податоци за чип-крај на спарен крај, фрагментите се врзуваат околу факторот на транскрипција со одредено растојание на раздвојување. Секвенционирањето на парен крај овозможува попрецизна проценка на просечната должина на фрагментот, давајќи подобра проценка на геномските региони каде што се случило повеќе врзување. Заплетот за корелација на жиците покажува врвна вредност на збогатувањето што одговара на предоминантната должина на фрагментот. Како на слика 5најдено, пресметаната должина на фрагментот е 130 бп, додека читањето трае 50 бп. Податоци за ChIP-Seq каде должината на фрагментот е подолга од читањето е показател за висок квалитет 16 .
Во комплементарните методи на Силико на експериментот ChIP-Seq се анализа на збогатување на мотиви и пребарување на мотиви на ново. Бидејќи врзувањето на Олиг2 во ОПЦ не беше испитано претходно, Олиг2 ЧИП-Сек добиени самитски мотонеурон прогениторни клетки и ембрионални матични клетки беа користени за идентификација на мотивот де ново, 4, 24. Идентификуваните мотиви на ОЛИГ2 де Ново беа додадени во сеопфатната база на податоци за мотиви ЕНКОДЕ 25 и беше извршена анализа на збогатување на мотиви. Високо збогатување на идентификувани мотиви OLIG2 de de novo и познат фактор на транскрипција (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 и ASCL1) мотиви беа пронајдени во ChIP-Seq врвовите на прочистените клетки PDGFRα. Со збогатување на 30 де нови се идентификуваат мотивите со Е-вредност Слика 7 ги покажува првите два идентификувани мотиви на Ново на Олиг2. Овие два идентификувани мотива на Олиг 2 беа пронајдени во> 60% прочистени клетки PDGFRα, извлечени од врвовите ЧИП-Сек, покрај познатите мотиви.
Дискусија
По вкрстено поврзување на прочистените OPC, вкрстено поврзаните клетки треба да се мијат со ладен раствор HBSS и преостанатите чекори на ChIP да се изведат на 4 ° C, во спротивно антителото не може правилно да ја таложи геномската ДНК.
Следниот важен чекор во овој протокол е подготовка на библиотека. За изградба на библиотека се користеше PCR засилување на материјалот ChIP. Бројот на циклуси на PCR за подготовка на библиотеката зависи од количината на ДНК. Добрата библиотечна подготовка бара точна квантификација на количината на добиена ДНК. Премногу или премалку циклуси на PCR можат да влијаат на концентрацијата на библиотеката, како и на комплексноста што доведува до артефакти на PCR.
Тешко е да се конструира библиотека ChIP-Seq кога имате ограничен број на ќелии што треба да ги користите за имуно-врнежи 27. Стандардниот протокол ЧИП користен до денес, бара 10 ng на имунопреципитирана ДНК-ЧИП-Seq библиотечна подготовка 1, 28. Сепак, опишаниот протокол овде нормално генерира 2 ng имунопреципитирана ДНК од страна на Олиг2 антитела од 20 000 OPC. ДНК се користи за подготовка на библиотеката ChIP-Seq преку метод на адаптер во еден чекор што овозможува подобрена чувствителност овозможувајќи засилување на пикограмите на имунопреципитирана ДНК. Комбинирање на комерцијални комплети, овој протокол нуди практично решение за извршување на ChIP-Seq за транскрипциски фактори засновани на мал број клетки.
Важно е, опишаниот протокол со низок клеточен чип-сек е применлив за чип-сек од други фактори на транскрипција во примарни клетки или ретки клетки, исто така,. Антителата што се користат во овој протокол мора да се проверат експериментално за да се спроведе најпрво специфичен IP-експеримент. Неспецифичното врзување на антителата доведува до слаби резултати. Покрај тоа, се препорачува да се спроведе овој експеримент со ниски клетки ChIP-Seq во клетки со висок израз на факторот на транскрипција од интерес.
За анализа на податоци, може да биде тешко да се одлучи кои вредности ќе се користат како прекин откако ќе се повика врвно филтрирање. Во зависност од целта на анализата, може да се користат построги или порелаксирани параметри. Типично, се користи комбинација на збогатување на одделот и р-вредност или FDR. Ако некои места за врзување на факторот на транскрипција беа претходно познати под студијата, ова може да помогне во одредувањето на праговите на филтрирање. Бази на податоци што ги врзуваат веб-страниците за транскрипција на фактори од јавно достапни експерименти со ChIP-Seq во различни клеточни линии и услови се собрани 29, 30. Може да се побара ген и да се провери дали претходно се пронајдени места за врзување на факторите на транскрипција. Сепак, важно е да се знае дека местата за врзување на факторите на транскрипција се разликуваат во зависност од типовите и условите на клетките.
Во Силико дополнителни методи на Експериментот ChIP-Seq се анализа на збогатување на мотиви и пребарување на мотиви de novo со MEME-ChIP 20 или слични програми. Потрагата по мотиви бара сеопфатна позната и де ново изведена база на податоци за мотиви z. Б. Модиви за кодирање 25 или база на податоци за хокомоко 31. Хокомоко е база на податоци со мотиви откриени од јавно достапни експерименти со ЧИП-Seq со луѓе и глувци. Ако мотивите за претпоставениот протеин не се познати, пребарувањето на мотиви de novo може да открие повторувачки обрасци на низа во значителен дел од врвовите како нови мотиви. Комбинаторните опции за дејствување на факторите на транскрипција можат да бидат претставени доколку се најдат и мотиви од други фактори на транскрипција збогатени со добиените врвови.
Збогатените врвни региони може да се потврдат експериментално користејќи го хроматинот на мутираните или нокаут клетките како контроли. Спроведување на ChIP-Seq со клетки кои не го изразуваат факторот на транскрипција се користат за идентификување на лажно позитивни врвови, исто така познати како „фантомски врвови“ 32. Лажно позитивните резултати се филтрираат.
Интересно е и да се споредат добиените врвови на ChIP-Seq со транскриптомски податоци. Врвовите на PDGFRα-Olig2 ChIP-Seq беа споредувани со експресијата на гените во OPC од претходната публикација 18. Оваа стратегија може да биде ограничена бидејќи механизмите што ги врзуваат изразените гени во OPC, бидејќи факторот на транскрипција на Olig2 може да се контролира. Покрај тоа, факторот на транскрипција Олиг2 може да врзува генски регулаторен регион, но генот може да има ниски нивоа на експресија на генот поради можни инхибиторни механизми или недостаток на ко-фактори неопходни за генска транскрипција.
ChIP-Seq е метод што се користи за идентификување на местата за врзување на ДНК широк геном за фактори на транскрипција и други протеини. Сепак, со анализа на истовремена појава на фактори на транскрипција, истражувачите откриле дека факторите на транскрипција имаат тенденција да се поврзат со други протеини кои го формираат Co Module 33. Ова значи дека некои врски помеѓу транскрипционите фактори и геномската ДНК откриена од ChIP-Seq се индиректни и се премостуваат од други протеини. Оттука, со цел да се добијат позначајни резултати, истражувачите треба да проучат повеќе фактор на транскрипција истовремено.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Откривање
Авторите наведуваат дека немаат финансиски судир на интереси.