Имунохистохемиска и клеточна биолошка анализа на човечки моноклонални антитела против колоректален

Од Патолошкиот институт на Извршниот одбор на Универзитетот во Вирцбург: професор др. медицински Х.К. Милер-Хермелинк имунохистохемиска и клеточна биолошка анализа на човечки моноклонални антитела против карцином на дебелото црево Инаугуративна дисертација за добивање на докторат од Медицинскиот факултет на Универзитетот „Баварски Јулиус Максимилијанс“ во Вирцбург, претставена од Judудит Лоренц од Фулда Вирцбург, јуни 2004 г.

имунохистохемиска

Говорник: професор др. рер. нат Д-р медицински Х.П. Ко-судија на Волмер: професор др. медицински Х.К. Дилер на Милер-Хермелинк: Професор Др. медицински С. Силбернагл Ден на орален преглед: 21 јануари 2005 година Кандидатот за доктор е доктор

моите родители, Улрих и Кристијан

Содржина 1 Вовед 1 1.1 Колоректален карцином 1 1.2 Моноклонални антитела 6 1.3 Цел на работата 11 2 Материјали и методи 12 2.1 Материјал 12 2.1.1 Бафери, раствори и медиуми 12 2.1.2 Хемикалии и антитела 13 2.1.3 Хумани моноклонални антитела 14 2.1 .4 Мобилни линии 15 2.1.5 Потрошен материјал и лабораториска опрема 15 2.1.6 Софтвер и хардвер 16 2.2 Методи на имунохистохемија 17 2.2.1 Подготовка на замрзнати делови 17 2.2.2 Градиент на фикол и подготовка на цитоспини 17 2.2.3 Боење на имунопероксидаза на криосекции и цитоспини 18 2.3 Методи на клеточна биологија 20 2.3.1 Клеточна култура 20 2.3.2 Тест за пролиферација (МТТ анализа) 20 2.3.3 Откривање на смрт на клетките ELISA PLUS (Рош, Манхајм) 21

3 Резултати 23 3.1 Боење со имунопероксидаза 23 3.1.1 Колоректални карциноми 24 3.1.2 Нормално ткиво 28 3.1.3 Фетално ткиво 34 3.1.4 Туморско ткиво 35 3.2 Тест за пролиферација (МТТ анализа) 39 3.3 Откривање на смрт на клетките ELISA PLUS (Рош, Манхајм) 42 4 Дискусија 45 5 Резиме 58 6 Библиографија 59 7 Список на кратенки 75 признанија CV

Вовед 11 1.3 Цел на тезата Во оваа теза, три човечки моноклонални антитела, кои беа развиени во работната група на проф. Х.П. Волмерс на Патолошкиот институт на Универзитетот во Вирцбург со помош на технологија на хибридома (опишано во: Волмерс и сор., 1989) беа изолирани од пациент со рак на ректумот, испитан во однос на вкрстената реакција со здраво и малигно дегенерирано ткиво. За таа цел, дамките од имунопероксидаза беа извршени на замрзнати делови на разни нормални и фетални ткива и на бројни видови тумори. Понатаму, влијанието на антителата врз однесувањето на растот на различните клеточни линии на карцином на дебелото црево се карактеризира ин витро со помош на два функционални биолошки теста на клетките (анализа на MTT, клеточна смрт ELISA PLUS). Податоците добиени преку оваа работа треба да обезбедат првични информации за соодветноста на антителата како терапевтски агенси за малигни тумори на дебелото црево и на тој начин евентуално да претставуваат основа за понатамошни истражувачки пристапи.

Материјал и методи 12 2 Материјал и методи 2.1 Материјал 2.1.1 Бафери, раствори и медиум PBS: 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,15 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 0,2 g KH 2 PO 4 1 l A. кандидат. Tris/NaCl: Раствор 1: 4,5 l A. повторно. 40,5 g раствор на NaCl 2: 1 l A. повторно. Наместете 6 g трис (хидроксиметил) аминометан на pH 7,6 со испарувачки HCl прилагоден раствор 1 и 500 ml раствор 2 на pH 7,4 BSA/PBS: 5 mg BSA (албумин говеда, дел V; Рот, Карлсруе)/ml PBS DAB реагенс: 5 ml вода од чешма 1 таблета DAB, 1 таблета водород пероксид (5 ml таблета Sigma Fast 3,3'-Диаминобензидин; Сигма, Штајнхајм) MTT реагенс: 3- (4,5-диметилтиазол-2- ил) -2,5-дифенилтетразолиум бромид (Сигма, Штајнхајм) 5 mg/ml PBS Обезмастено млеко во прав: од продавницата за здрава храна, 3 или 5% во PBS

Материјал и методи 13 Трипан сино: 0,5% трипан сино (Сигма, Штајнхајм) 0,9% NaCl зајачки серум: Линарис, Вертхајм-Бетинген Човечки серум: од Катедрата за трансфузиона медицина на Универзитетот во Вирцбург RPMI 1640: основен медиум (500 ml) Линц/Австрија) 1% глутамин (5 ml) 1% пеницилин/стрептомицин (5 ml) 10% FCS (серум од фетално теле) (50 ml) се загрева на 37 C пред употреба Trypsin/EDTA: PAA Laboratories, Linz/Austria 2.1. 2 хемикалии и антитела Хемикалиите и антителата се добиени од следниве компании: Откривање на ацетон-клетка на смртта ЕЛИСА ПЛУС ДМСО (диметил сулфоксид) Метод за раздвојување глицерин желатин хемалаун ткиво-Теки Малинкродт Бејкер, Девентер/Холандија Роче, Манхент Вајтхајм, Бархен Мерк, Дармштад Мерк, Минхен Сакура Финетек, Зетервуд/Холандија анти-цитокератин (CAM 5.2) реагенс Бектон Дикинсон, Белгија

Материјал и методи 15 2.1.4 Мобилни линии Експериментите беа спроведени на утврдените линии HT-29, CACO-2, COLO 206F и COLO 320. Освен COLO 320, сите покажуваат приврзан раст на шишето со културата. Одгледувањето се одвиваше во RPMI 1640 медиум/1% глутамин/1% пеницилин/стрептомицин/10% FCS на 37 C и 7% CO2. 2.1.5 Потрошен материјал и лабораториска опрема Потрошувачките материјали се снабдувани од следниве компании: Комбинирани пипети покриваат чаши Комора за броење на Neubauer Слајдови, совети за пипети, садови за реакција и пластични контејнери, S-моновети и канили, плочи и шишиња со клетки, картони со цитофилтер, Епендорф, Хамбург, специјалист за асоцијација на лаборатории Хартенштајн, Вирцбург Менцел; Лангенбринк, Емендинген Грајнер, Фрикенхаузен; Хартенштајн, Вирцбург Грајнер, Фрикенхаузен; Хартенштајн, Вирцбург Сарстет, Нимбрехт Гринер, Фрикенхаузен Хартенштајн, Вирцбург Уредите што се користат за работа доаѓаат од следниве компании: Аквабидист систем Milli-Q Plus PF инкубатори Читатели на ELISA Millipore, Molsheim Heraeus, Hanau Bio-Rad, Минхен

Материјал и методи 16 Замрзнувач (-70 C) Cryostat 2800 Frigocut N Фрижидер и замрзнувач Магнетски мешалка IKAMAG RTC микроскоп DMLB фазен контрастен микроскоп DMIL ph-метар ph 525 пипети помош за пипетирање акумулациона стерилна клупа Lamin Air Vortex-Genie водена бања Miniterm 2 центрифуга центрифуга Цит 2 Хереј, Ханау Рајхерт-Јунг, Нуслох Квеле, Фирт Јанке и Кункел, Стауфен Леика, Вецлар Леика, Вецлар ВТВ, Вајлхајм и. Градоначалник Епендорф, Бренд Хамбург, Вертхајм/Маин Хереј, Ханау Бендер и Хобеин, Цирих/Швајцарија Сарториус, Гатинген Динкелберг-Лабортехник, Ној-Улм Хереј, Ханау Шандон, Велика Британија 2.1.6 Софтвер и хардвер За графички приказ на резултатите, Користени програми EXCEL и POWERPOINT (Microsoft, САД). Фотографските снимки на деловите од ткивото се направени со помош на дигиталниот фотоапарат Nikon Coolpix 990 (Nikon, Јапонија) и DMLB микроскопот (Leica, Wetzlar) со зголемување од 100, 200 и 400 пати, а отпечатокот е направен на фото-хартија (Hewlett Packard, САД) од печатач во боја од иста марка.

Резултати 25 Резултатите од боењето со HH 98/81-33-154 и HH 99/71-81-149 беа идентични и ако овие две антитела реагираа позитивно, боењето со HH 101/99-14 исто така беше позитивно . Ова беше случај за вкупно 7 карциноми. На сликите од 1 до 4 е прикажан пример на позитивно боење со HH 98/81-33-154 и HH 99/71-81-149, како и послаба и посилна реакција на HH 101/99-14 на колоректалното туморско ткиво. За споредба, негативните реакции на сите три антитела со неопластично ткиво на дебелото црево се прикажани на слика 5. a b c Сл. 1: Зголемување на дебелото црево во аденокарцином: 100 пати а: позитивна контрола (CAM 5.2) b: негативна контрола (L11/64-28) c: позитивна реакција со антителото HH 98/81-33-154

Резултати 26 abc Сл. 2: Зголемување на дебелото црево во аденокарцином: 10x a: Позитивна контрола (CAM 5.2) b: Негативна контрола (RPMI 1640) c: позитивна реакција со антителото HH 99/71-81-149 abc Сл. 3: Зголемување на дебелото црево на аденокарцином: 10 пати a: позитивна контрола (CAM 5.2) b: негативна контрола (L11/64-28) c: слабо позитивна реакција со антителото HH 101/99-14

Резултати 27 а б в г Сл. 4: Аденокарцином на цекумот кој содржи клетки на знак на прстен Зголемување: 200 пати а: HE боење б: позитивна контрола (CAM 5.2) в: негативна контрола (RPMI 1640) г: силно позитивна реакција со антителото HH 101/99-14

Резултати 28 abcd Сл. 5: нормално зголемување на ткивото на дебелото црево: 200 пати а: негативна контрола (L11/64-28) b, c, d: негативни реакции на антителата HH 98/81-33-154, HH 99/71-81-149 и HH 101/99-14 со неопластични колони жлезди 3.1.2 Нормално ткиво Бидејќи антигените поврзани со туморот препознаени од антителата можат да бидат молекули кои се изразени и од здрави клетки, потребно е да се идентификуваат можните вкрстени реакции на Да се ​​откријат антитела со важни органи за да може да се извлечат првични заклучоци за компатибилноста на антителата во подоцнежна терапевтска употреба.

Резултати 30 Орган бр. Пронајден HH 98/81-33-154 HH 99/71-81-149 HH 101/99-14. + + + Дебелото црево 3 0 3 0 3 0 3 ректумот 3 0 3 0 3 0 3 панкреасот 2 0 2 0 2 0 2 црниот дроб 3 не може да се оцени слезината 3 не може да се оцени тимусот 3 0 3 0 3 0 3 тонзила 3 ​​0 3 0 3 0 3 лимфни јазли 3 0 3 0 3 0 3 надбубрежна жлезда 3 0 3 0 3 0 3 бубрег 3 0 3 0 3 0 3 мочен меур 3 0 3 0 3 0 3 дуктус деференс 3 0 3 0 3 0 3 простата 3 0 3 0 3 0 3 тестиси 3 0 3 0 3 0 3 дојки 3 0 3 0 3 0 3 јајници 3 0 3 0 3 0 3 tuba uterina 3 0 3 0 3 0 3 corpus uteri 2 0 2 0 2 0 2 грлото на матката, портио ваг. 2 0 2 0 2 0 2 кожа 3 0 3 0 3 0 3 скелетен мускул 3 0 3 0 3 0 3 плацентата 1 0 1 0 1 0 1 'рбетниот мозок 3 0 3 0 3 3 0 церебралниот кортекс 3 0 3 0 3 1 2 малиот мозок 3 0 3 0 3 3 0 Corpus pineale 2 0 2 0 2 2 0 Хипофиза 3 0 3 0 3 3 0 Коскена срцевина 2 0 2 0 2 0 2 Крв 2 0 2 0 2 0 2