Ин витро модел за мерење на имунолошки реакции на маларија во контекст на ХИВ-инфекција

Вовед

Коинфекција, инфекција со повеќе истовремени инфекции, е норма во природните услови. Коинфекцијата може да има големо влијание врз патологијата на болеста и клиничкото управување со секоја инфекција. Во врска со истоинфекција, вакцината и ефикасноста на лековите, како и дијагностичките тестови можат да бидат негативно под влијание (преглед во 1). И покрај нивната важност, мнозинството истражувања за патогени разгледува само индивидуални инфекции.

Маларијата и ХИВ-1 (ХИВ) се водечките причини за морбидитет и морталитет ширум светот. Областите на маларија и ендемитност на ХИВ имаат широко географско преклопување, со што милиони луѓе се изложени на ризик од потешка клиничка болест 2-10. Двете болести влијаат негативно. Кај индивидуи инфицирани со ХИВ, повисоки вирусни оптоварувања со ХИВ и минливо намалување на бројот на Т-клетки ЦД4 + се забележуваат за време на инфекција со маларија, додека оптоварувања на паразити од маларија и ризици од клиничка и тешка маларија се забележани кај лица кои се инфицирани со 2,3,5,7, 8,10 повисоко. Механизмите со кои ХИВ ја зголемува сериозноста на маларијата не се целосно разбрани и бараат дополнителна истрага.

Овде опишуваме метод со кој маларијата и ко-инфекцијата со ХИВ може да се изучуваат ин витро. Особено, овој метод овозможува проучување на специфични за маларијата, имунолошки одговори во врска со ХИВ инфекција. Нашиот протокол опишува разноврсен кокултурен систем на свежо изолирани мононуклеарни клетки на периферната крв (PBMC) од хронично донатори заразени со ХИВ и еритроцити паразитирани со P. falciparum (PfRBC) култивирани ин витро. Ефектите на ХИВ антиретровирусната терапија врз овие одговори исто така може да се изучуваат со помош на проспективно снимени PBMC од донатори на ХИВ (+) пред и по третманот.

Го користеше овој систем за да го проучи влијанието на ХИВ инфекцијата врз специфичните за маларија вродени имунолошки одговори 11,12 и беше во можност да утврди дека одговорите специфични за маларијата IFNy и TNF се нарушени во НК клетките, НКТ клетките, γδ Т-клетки од донатори на ХИВ (+) пред и по ХИВ антиретровирусна терапија. Покрај тоа, можевме да го искористиме овој систем за да утврдиме дека функциите на моноцитите се исто така нарушени кај донаторите на ХИВ (+), но се опоравуваат по антиретровирусна терапија со ХИВ.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Овој протокол бара регрутирање на донатори за серум и РБЦ да се користи за култура на паразити и ХИВ (+) и неинфицирани донатори за изолација на PBMC. Институционалните одбори за преглед мора да ги одобрат сите студии и сите донатори да дадат информирана согласност пред да земат крв.

ПРЕДУПРЕДУВАЕ: Работата со примероци од човечка крв и паразити кај човечката маларија бара мерки на претпазливост. Секогаш носете лабораториско палто, ракавици и работете во кабинет за биосигурност на ниво 2. Во случај на случајно перкутано изложување на маларија кај луѓето, известете за здравјето и безбедноста за профилактички третман. Исто така, треба да се стават дополнителни безбедносни проверки на лице место за работа со ХИВ (+) крв. Носете палто за заклучок во лабораторија. Двојна ракавица (горната ракавица треба да биде латекс). Изведете го целото ракување во кабинет за биосигурност на ниво 2. Не користете стакло или остри предмети. Не користете пумпа за воден млаз. Ставете ги сите контаминирани делови од раствор на вирокс или белило најмалку 1 час пред отстранување, 1 час по нанесувањето, измијте ги сите површини со вирокс и УВ. Имајте на ум дека секоја институција ќе има свои специфични регулативи за биосигурност кои мора да се следат. Известете какво било случајно изложување на здравје и безбедност на крв заразена со ХИВ за евалуација и разгледување на можна профилакса по експозиција.

ЗАБЕЛЕШКА: Присутни се различни видови на паразити на маларија на P. falciparum. За овие експерименти се користеше ITG, но се користат различни видови. Одлични упатства за замрзнување и топење на паразитите на плазмодиум фалципарум се достапни на веб-страницата MR4 13.

1. Создадете RPMI-A за културата на маларија

Направете RPMI-0 со мешање на 950 ml ddH 2 O, 1 пакет RPMI-1640 прав, 6 g HEPES, 2 g натриум хидроген карбонат и 1,35 mg хипоксантин.
Одмрзнете го топлинскиот инактивиран човечки серум од два различни донатори. Донаторите на АБ се најдобри, но може да се користат кога паразити се одгледуваат во црвени крвни клетки од типот О (РБЦ). Метници за чистење да се мешаат. Ако серумот содржи честички или е густ вртење при 2000 вртежи во минута и потоа изберете течен дел користејќи филтерска единица 0,45 µm.
Користење на 0,2 μ m филтер единица филтер 180 ml RPMI-0, 20 ml хуман серум (10 ml од секој донатор) и 0,5 ml 10 mg/ml гентамицин.
Забелешка: Човечки серум може да ги заглави филтрите, затоа се потребни повеќе од една единица за филтрирање.
Етикета на средното шише со RPMI-A, датумот и изворот на серумот. Сладете се додека не биде потребно. RPMI-A може да стане облачно кога се лади. Ова е нормално, но зголемувањето на облачноста е знак на контаминација.
Забелешка: растот на паразитот во различен донор серум ќе варира. Добра идеја е да се тестираат сите многу човечки серуми за добар раст на паразитот пред да се користи.

2. Подготовка на човечки црвени крвни клетки за култура на паразити

Забелешка: Дарителите на крв треба да бидат од типот О.

Соберете 7-10 ml крв во цевки со киселина цитРејт-декстроза (ACD). Напишете го ID на донаторот и датумот на собирање на етикетата.
Чувајте крв на 4 ° C додека не биде потребно. За крвниот паразит, користете култури во рок од 1 месец.
Избришете го горниот дел од цевката со 70% етанол. Внимателно отстранете го затка и фрлете го. Пренесете крв во цевка од 15 ml. Врти 3 мин на 1000 x g. Отстранете ја плазмата со аспирација.
Изложување на RBC со еднаков волумен на топол RPMI-0. Врти за 5 мин на 1000 x g. Отстранете ја масната кожа со вшмукување, ресуспензија во 5 ml RPMI-0 и повторете го миењето уште 2 пати.
Отстранете го супернатантот и додадете доволно RPMI-A за да се добие мешавина што е 50% RBC по волумен.
Да се чува на 4 ° C се додека не биде потребно.

3. Одржување на култури на паразити

4. Синхронизација на паразити

ЗАБЕЛЕШКА: Еден ден пред експериментот, синхронизирајте ја културата на паразити со лекување со аланин. Само паразити во фаза на прстен и неинфицирана РБЦ ќе го преживеат овој третман. Аланинската синхронизација ви дава чиста трофозоитна култура следниот ден што може да се користи во експериментите за кокултура. Бидете сигурни да започнете со култура на паразити што содржи мнозинство од паразити во фаза на прстен.

Подгответе аланин со мешање на 8,01 g аланин (300 mM) и 0,365 g Tris (10 mM) во 300 ml ddH 2 O. Донесете ја pH вредноста на 7,4. Стерилизиран филтер со употреба на 0,2 μ m филтер единица.
Пред-топол раствор на аланин на 37 o C.
Свртете ја културата на паразити (5 мин. X 1.000 х g) и извадете ја средината.
Пелети во 19 количини на раствор на аланин (1 ml спакувана RBC до 19 ml раствор на аланин). Инкубација 15 мин на РТ.
Спин 5 мин. X 1.000 х г. Супернатантот е цицан. Измијте еднаш во RPMI-0. Супернатантот се аспирира и пресуспендира во RPMI-A и се поставува хематокрит

3% Исто како колбата и вратете се на 37 ° C
Забелешка: За ко-културни експерименти потребно е минимум 5% трофозоитна паразитемија, со 10% паразитемија за оптимална.

5. Подготовка на паразити и РБЦ за експерименти со кокултура

Користете сооднос од 3 PfRBC на PBMC во експерименти со кокултура за да предизвикате инфламаторен одговор. За да се пресмета вкупната PfRBC, се измери паразитемијата со земање тенка крвна размаска, како што е опишано во 3.5, и хематокрит со броење на бројот на RBC на ml паразитна култура со комора за броење.
Број на PfRBC =% паразитемија x вкупна RBC/ml x ml култура. На пример: 10 ml култура на 10 x 10 6 RBC/ml и 10% паразитемија е еднаква на 0,1 x 10 6/ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC.
Вртете ја културата на паразити 5 мин на 1000 xg (РТ). Аспират медиум и ресуспензија на 6 x 10 6 PfRBC на ml во RPMI-S + (500 ml RPMI-1640, дополнет со Л-глутамин и HEPES, 10% инактивиран FBS додаден во топлина, 1,5 ml гентамицин, 5 ml 100 mM натриум пируват, 5 ml 10 mM MEM неесенцијални аминокиселини, 5 ml 5 mM β-меркаптоетанол).
Контролната крв (неинфицирана РБЦ од истиот донатор што се чувал во културата на паразити), пресметан хематокрит и повторно суспендиран во RPMI-S + во ист број на РБЦ по мл на паразитска култура.

6. Изолација на човечки мононуклеарни клетки на периферната крв (PBMC)

7. Култура на ко-инфекција со маларија/ХИВ

8. Откривање на имунолошки одговори на маларија

ЗАБЕЛЕШКА: Изведете експерименти со кокултура 4 дена. За ова време не е потребна промена на медиумот. Оптималното време ќе зависи од типот на ќелијата што е заинтересиран и од поставеното прашање. Инкубација од 12 до 48 часа е оптимална за одговорите на моноцитите на PfRBC, додека одговорите на лимфоцитите најдобро беа забележани на 72-96 часа. Времето ќе треба да се оптимизира врз основа на експерименталното прашање. Може да се користат пократки периоди (2-4 часа) кога е од интерес интеракцијата помеѓу недопрените PfRBC и PBMC.

Вртете ја плочата на 300 × g 3 минути на клетките на пелети. Соберете 700 μl суперинатантна култура од секој бунар.
Вртете го супернатантот на 1000 xg за 5 мин за да избегнете туѓи тела.
Исчистете го супериортот по потреба, означете го, префрлете го и оставете го на -20 ° C сè додека анализата на излачените фактори не биде LeistRMED.
Анализирајте ги одговорите на цитокин/хемокин со ELISA или со склоп на зрна (следете ги предложените протоколи на производителот).
Соберете ги клетките што остануваат во плочата во раствор за стабилизација на РНК и користете ги за анализа на изразување на mRNA со помош на квантитативна PCR 14-16 во реално време.

9. Интрацелуларна цитометрија на проток за одговори на специфични клетки на цитокини со употреба на РБЦ инфициран со фалципарум P. PBMC

Белешка: Како што споменавме погоре, должината на ко-културата ќе зависи од типот на ќелијата што го интересира. Доколку сте заинтересирани за моноцитни одговори, потребен е пократок период на инкубација на PfRBC. Пати подолго за вродени одговори на лимфоцитите (Т-клетки, НК-клетки, НКТ-клетки) и уште повеќе за ЦД4 и ЦД8 Т-клетки. Потребна е оптимизација.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Графиконите ги покажуваат нивоата на IFN & ggr; Производство на клетки на НКТ (Слика 2), со CD56 + CD3 + γδ- порти за зачувување на популацијата на клетките на НКТ (податоците не се прикажани). Клетките биле култивирани 72 часа пред да се бојат. Откако ќе се обојат, 100.000 ЦД3 + клетки беа снимени на цитометарот за проток за да се добијат доволно големи популации на НК, НКТ и γδ клетки (заинтересирани клетки). Минимум 5600 НКТ-клетки се прикажани на секој графикон. Производството на TNF се добива на ист начин (податоците не се прикажани). Графиконите јасно покажуваат дека IFN & ggr; Производството е помало кај клетките на ХИВ (+) лица наспроти ХИВ (-) лица изложени на PfRBC.

Анализата на проточна цитометрија е многу субјективна. Затоа е важно да ги имате сите соодветни контроли за секој експеримент (види Слика 2). Вредностите на позадината се пресметуваат со примероци на ФМО, што овозможува вистинска претстава за боењето со цитокин. Клетките стимулирани со ПМА/јономицин се користени како позитивни контроли (податоците не се прикажани). PMA и јономицин се моќни стимулатори на производството на цитокини во Т-клетките. Недостаток на производство на IFN во овие примероци, најверојатно, би бил проблем со протоколот за боење. Сепак, други варијабли, како што се одржливоста на клетките или неактивните реагенси, исто така може да бидат виновни.

Слика 1. Илустрација на Ficoll Gradient Post Spin докази за позицијата на PBMC.

Слика 2. Производство на IFN γ од природни убијци Т-клетки. Графиконите на проток се добиени со порти на ЦД56 + ЦД3 + γδ клетки (минимум 5.600 настани). Производството на IFNy се забележува во примерокот на ХИВ (-) стимулиран со П. falciparum инфицирани црвени крвни клетки. Овој одговор на цитокинот повеќе не е видлив во контекст на хронична ХИВ инфекција. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа бројка.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Нашиот протокол е оптимизиран за да се проучи ко-инфекцијата со ХИВ-маларија најреално in vitro. Прво, потребни се свежи човечки еритроцити и серум за културата на паразити во маларијата. Ова е од клучно значење за одржување на здрава популација на паразити од маларија. Паразитни лизати не можат да бидат заменети со живи паразити бидејќи производството на цитокин е многу побрзо и поинтензивно кога се користи жив П. фалципарум инфициран РБЦ (PfRBC) 17,18. Дополнително, активирање на типови на клетки, како што се НК-клетки, бара вкупни PfRBC и не се справува ефикасно со лизати на паразити. Ова може да се должи на потребата за директен контакт помеѓу PfRBC и леукоцити или може да се должи на нестабилната природа на лиганд добиен од паразити кои комуницираат со рецепторите на клеточната површина 18. Културите на маларија PfRBC исто така мора да бидат добро синхронизирани (Протокол 4) пред експериментот. Синхронизирани PfRBC за подобрување на репродуктивноста на експерименталните податоци. Иако овој протокол deSchreiber користи фаза на трофозоит PfRBC за кокултура, тој лесно може да се модифицира за проучување на прстенестата фаза PfRBC.

Хуманите леукоцити се вештачки заразени со ХИВ, а методот е користен во студиите на истражување на ко-инфекција со маларија-ХИВ 20. Сепак, ова не ја моделира имунолошката дисрегулација што доведува до хронична ХИВ инфекција. Во овој систем на кокултура користиме PBMC изолирани од човечки учесници кои се хронично заразени со ХИВ-1. Доколку е потребна студија за учесниците, важно е внимателно да се избере таа популација. Критериумите за вклучување и исклучување се клучни за да се обезбеди минимална варијабилност и максимална репродуктивност. Нашите критериуми беа јасна дефиниција за хронична ХИВ инфекција (> 1 година заразена со ХИВ, со намалување на бројот на Ц4-Т клетки од> 50 клетки/мм 3/година) и исклучување на секој со истовремена инфекција. Ова осигурува дека добиените резултати може да се припишат на ефектите на хроничната ХИВ инфекција, а не на некоја друга инфекција. Покрај тоа, бидејќи бевме заинтересирани за вроден имунолошки одговор да ја исклучиме маларијата, ние бевме донатори кои имале претходна инфекција со маларија.

Контроли заразени со ХИВ се користат за секој донатор на ХИВ (+), во секое време на примерок, што овозможува нормализирање на податоците. Треба да се направи обид да се совпаднат контролите врз нивните донатори на ХИВ (+) најмалку за возраста, но по можност и за полот (иако во претходната студија 12 не забележавме значителна разлика во клеточните подмножества или одговорите на цитокини помеѓу жени и мажи Учесници инфицирани со ХИВ). Доколку е закажано потенцијално земање примероци, одржувањето на истата контрола заразена со ХИВ за секое време на земање мостри е од корист. Експерименталните одговори варираат врз основа на неколку фактори, вклучувајќи го и здравјето на PfRBC, нивниот степен на синхронизација, нивоа на паразитемија и зрелост на PfRBC и нивоа на хематокрит. Мора да се внимава што поголем број од нив да бидат во хармонија помеѓу експериментите. Нормализирањето на контролата заразена со ХИВ ви овозможува одредено сметководство за овие варијабли.

Имањето свежи клетки е од најголема важност за да се избегнат вештачки резултати. Примероците за замрзнување и топење можат да имаат значително влијание врз одржливоста на клетките 21,22, производството на цитокини 23-26 и фенотипните маркери на површината на клетките 27.

Ако моноцитите се од посебен интерес, важно е стаклото да не се користи во протоколот. Моноцитите на стаклото и на многу други пластики 28 мора да се набудуваат. Ние користиме полипропиленски пластични пипети, пипети и цевки насекаде за да ја минимизираме адхезијата на моноцитите и крајното отстранување од популацијата на нашите клетки.

Опишаниот протокол е разноврсен и може да се користи за проучување на реакции во рок од часови или денови во зависност од заинтересираните клетки. За оптимално производство на цитокини предизвикани од PfRBC од вродени лимфоцити, измеривме почетна цитометрија на проток по 2 или 3 дена. Кога гледате моноцити, се препорачуваат претходни временски точки (1 или 2 дена). Овој систем овозможува повеќекратни типови клетки и одговорите на клетките да се разликуваат со проточна цитометрија, секреторните одговори да се измерат во клеточните супериенти и да се проценат изразните профили во извлечената РНК. Понатаму, употребата на антитела за блокирање или неутрализирање на специфични рецептори; цитокини може да се користат во овој систем за понатамошно расчленување на механизмите. Успешно ја искористивме блокадата на рецепторот на IL-18 за да имплицираме рецептори на IL-18 во одговорите на Ifn 12 предизвикани од PfRBC. Овој систем обезбедува реален метод со кој може да се процени низа вродени имунолошки реакции на маларија поврзани со ХИВ инфекција.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.