Индукција на атеросклеротични плаки преку активирање на минералокортикоидни рецептори во

Резиме

Ние опишуваме протокол за индукција на атеросклероза во аортните корени на ApoE -/- глувци кои се хранат со атерогена диета преку континуирано ослободување на алдостерон. Опишани се и методи за карактеризирање на составот на плаки.

Апстракт

Вовед

Неколку студии покажаа дека алдостеронот е вклучен во развојот на атеросклероза 8, 9, 10. Инфузија на алдостерон во ApoE -/- глувци кои се хранат со атерогена диета го забрзуваат развојот на атеросклеротични лезии кои предизвикуваат воспаление на коренот на аортата и формирање на плаки богати со липиди - 10 .

Сумирајќи, опишуваме протокол кој вклучува инфузија на алдостерон, хранење со атерогена диета, вградување на срцево ткиво, квантификација и карактеризација на атеросклеротични лезии кај глувци ApoE -/-. Оваа постапка промовира ефикасно формирање на воспалени, богати со липиди атеросклеротични плаки и претставува вреден модел за проучување на атерогенезата.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Студијата е финансирана од италијанскиот Национален институт за здравствена заштита и комитети за употреба, овластување бр. 493/2016-ПР. Сите постапки беа спроведени во согласност со упатствата на Европската заедница за употреба на лабораториски животни (Упатство за ЕУ 2010/63/UE).

Забелешка: Поткожна имплантација на осмотска мини пумпа со возило (етанол во солен раствор) или алдостерон (240 μg · кг -1 · д -1) кај машки глувци стари 8-10 недели несоодветни за генот ApoE. Општо, глувците стари 8-10 недели ApoE -/- тежат приближно 25-26 g.

Растворете 5 mg алдостерон во прав во 1 ml апсолутен етанол.
Солен раствор од 68,3 μL Додадете 56,7 μL алдостерон (растворен во етанол) за да добиете концентрација од 2,27 μg/μL. пополнете ја целата осмотска мини пумпа целосно со 125 μL од овој раствор (максималниот капацитет на секоја мини пумпа е 125 μL).
Користете брзина на проток на мини пумпа од 0,11 μL/час; Затоа, се ослободуваат 2,64 μL од растворот на секои 24 часа. Дајте му на секој глушец приближно 6 µg · d -1 алдостерон за 28 дена.

(2) полнење и имплантација на осмотска пумпа

Белешка: Пумпите се во два одделни дела: главниот дел на пумпата и регулаторот на проток.

3. дисекцијата на срцето

4. Исечете делови од коренот на аортата

ЗАБЕЛЕШКА: Сите чекори на боење пријавени во следниве протоколи се изведуваат во циклуси за боење стакло Коплин.

(6) Анализа на слика на атеросклеротични лезии во делови на коренот на аортата

Забелешка: Делови од коренот на аортата обоени со Oil Red O или MAC3 или антитело од интерес може да се обработуваат со употреба на соодветен софтвер (информации во Табела на материјали) да се анализира. Вкупното пикселно боење е позитивно за компонентата од интерес е нормализирана на вкупната површина на плаката. Сликите беа собрани и анализирани од истражен истражувач за третман.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

За 8-10 недели Апо -/- глувци биле вградени за инфузија со возило или алдостерон (Слика 1Е-1I) и се храни со атерогена диета (прилагодена диета со калории 42% од маснотии) 4 недели. На крајот од третманот, глувците биле еутанизирани и перфузирани со PBS со 10% формалин, како што е опишано погоре. Аортниот корен се оддели од апикалниот дел на срцето и беше вграден во ОАТ (Слика 2)) Пресеците на корените на аортата беа подготвени за различно боење со употреба на машина за криостат (Слика 3)).

Составот на атеросклеротична плака може да се карактеризира со боење на одредени компоненти кои ја дефинираат фазата на развој на плаката. Боење со маслена црвена боја О се користи за одредување на содржината на маснотии во атеросклеротичните лезии, како што е опишано во чекор 5.1, боењето со црвено Пикро Сириус се користи за одредување на содржината на колаген, како што е опишано во чекор 5.2, а боењето Mac3 се користи за мерење на содржината на макрофагите опишани во чекор 5.3. После 4 недели од третманот со алдостерон глувци, имаше значително зголемување на липидите (Слика 4А)-4 В.) и содржина на макрофаг (слика 4-4F) прикажани во атеросклеротични плаки на ниво на корен на аортата, но не се забележани разлики во содржината на колаген (Слика 4-4I) во споредба со глувците третирани со возилото. Навистина, во овој модел, алдостерон ја забрзува атерогенезата, предизвикувајќи васкуларно воспаление, но не и фиброза (Слика 4).

Илустрација 1: Подготовка и имплантација на осмотска мини пумпа со возило или алдостерон. ОД) Чекори за полнење на осмотски мини пумпи со возило или алдостерон. В) Чекори за затворање на телото на пумпата со регулаторот на проток. D-F) Чекори за создавање засек за вградување на пумпата на задниот дел од глувчето. Г-мене) Имплантација на осмотска мини пумпа и шијте го засекот. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 2: Подгответе се да го вградите и исечете срцето и коренот на аортата. ОД) срцето се сече попречно по права линија што ги поврзува долните точки на десниот и левиот атриум. Апикалниот дел од срцето се обработува за да се измери атеросклеротичната лезија во коренот на аортата. В) коренот на аортата од внатрешноста на срцето. Д-Е) Срцевата празнина е исполнета со октомври. Ѓ) Ориентација на срцето во расечена форма преполнета со OCT (со срцева празнина кон дното на обликот) G) Замрзнување на расеченото срце со ОКТ во калапот. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 3. Сечење на коренот на аортата со микротум на криостат. (А) Пред-ладете го криостатот и поставете ја точната температура за машината и чакот. Б-Д) Цврстиот блок ОКТ е одделен од калапот и вишокот на ОКТ во областа на срцето се елиминира со сечилото. Е-мене) Блокот на OCT е фиксиран со течен OCT, на потпората. Ј-К) Поддршката е вметната во облогата и е ориентирана со левата комора нанадвор. L-M) Дел од блокот се додека не се види целосно расеченото срце. Н-О) Поставете ја дебелината на 10 или 6 µm и соберете ги парчињата на стаклото. П-П) Проверете го присуството на сите три вентили под микроскоп. Р) Последователните парчиња се собираат, како што е прикажано, сè додека еден или повеќе вентили повеќе не се исполнети. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 4. Квантификација на составот на атеросклеротична плака Алдостерон - или ApoE третиран со возило -/-. ОД) репрезентативно црвено масло Обоени пресеци на коренот на аортата кај АПОЕ стари 8-10 недели -/- глувци со возило (А.) или (Б.) Третиран алдостерон и се храни со атерогена диета 4 недели. В) Квантифицирајте ја содржината на маснотии како процент на позитивно боење/вкупна површина на плаки. Д-Е) Претставникот Mac3 извалка пресеци на коренот на аортата. Ѓ) Квантифицирајте ја содржината на макрофагите како процент на позитивно боење/вкупна површина на плаки. G-H) Претставникот Пикро Сириус извалка црвени пресеци на коренот на аортата. Јас) Квантифицирајте ја содржината на колаген како процент на позитивно боење/вкупна површина на плаки. Вредностите се изразуваат како средна ± средна стандардна грешка (SEM; n = 6 за секоја група). Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Атеросклерозата е хронично воспалително заболување кое влијае на големи и средни садови со интеракции помеѓу повеќе типови клетки, како на пр. Б. Макрофагите, Т-лимфоцитите, ендотелните клетки и мазните мускулни клетки се доделени на клетките 1. И покрај ограничувањата на атерогените модели на глувци, има многу докази за атеросклеротичниот процес. Овие модели имаат предност во брзото генерирање експериментални групи од одредена возраст и пол. Глувците, исто така, покажуваат дефинирана и хомогена генетска позадина.

Развојот на атеросклеротични плаки, забележан кај модели на глувци подложни на артериосклероза, делумно потсетува на субјектите, со исклучок на нестабилното формирање на плаки 4 забележано. Руптура на плаки и последователна тромбоза, главната причина за миокарден инфаркт кај луѓето, не беа забележани во атерогени модели на глувци. Во нашите публикации покажавме дека инфузијата на алдостерон за да предизвика нестабилен фенотип на плакета во ApoE -/- глувци кои се хранат со HFD-10 по 4 недели. Всушност, овој третман може да ги зголеми плаките, содржината на маснотии и нивото на воспалителна површина на коренот на аортата, без значителна разлика кога ќе се спореди со нетретираните глувци 10 содржина на колаген. Забележете, овие глувци покажуваат зголемен развој на атеросклероза независна од хипертензија, со оглед на тоа што третманот со алдостерон во крвниот притисок не беше значително променет.

Во овој ракопис детално ја прикажуваме техничката постапка за вградување на срцевото ткиво во октомври, како и последователните чекори, т.е. Х. Исечете го коренот на аортата и анализирајте ја плаката. Во споредба со парафинот, ОКТ овозможува подготовка на пресек со голем опсег на дебели (1-100 μm) со микротум со криостат и минимална обработка на ткивото. Ограничувањата, исто така, можат да влијаат на квалитетот на замрзнатото ткиво, што потенцијално влијае на формирање на ледени кристали и да ги менува подклеточните детали и да произведува артефакти откриени со имунохистолошко боење. Всушност, се смета дека криопрезервацијата подобро ги зачувува антигенот и антигеноста. Всушност, замрзнатото ткиво ја зачувува структурата на антигените. Обработката на замрзнато ткиво за имунохистохемија исто така овозможува употреба на формалин, кој е токсична и канцерогена супстанца, да се избегне.

Известување Кога ќе се појават трите вентили, најдобро е да се исече ткивото на различни дебелини во зависност од видот на анализата што се прави. Всушност, некои слајдови се користат за да се утврди прогресијата на плаките, додека останатите слајдови може да се користат за различни дамки (на пример, Picro Sirius, Mac3, итн.).

Атеросклеротичните лезии кај глувци третирани со алдостерон се појавуваат богати со липиди и макрофагите се карактеризираат со употреба на Oil Red O (за липидно боење), Mac3 (за боење на макрофаг), Sirius red (за боење на колаген) или други специфични антитела од интерес Протеини. Важно е да се нагласи дека вградувањето во ОКТ, за разлика од вградување во парафин, избегнува употреба на органски растворувачи кои ја отстрануваат содржината на липиди во лезиите. Затоа, боењето на липидите со Oil Red O е изводливо во OCT вградени делови и содржината на маснотии во атеросклеротичните плаки може точно да се измери.

Во овој ракопис покажавме дека алдостеронската инфузија е вреден метод за промовирање на атеросклероза кај ApoE -/- глувците. Според, алдостеронската инфузија кај ApoE -/- глувците е во состојба: 1) да ја зголеми активирањето на ендотелните клетки, претставена со зголемена експресија на молекулите вклучени во адхезијата и миграцијата на моноцитите во раните фази на формирање на атеросклеротична плака 12, 13; и 2) содржина на липиди и про-воспалителни макрофаги за зголемување на аортниот корен фаза 10, 13. Овие ефекти не се должат на хемодинамичките ефекти на алдостерон 10. Сумирајќи, предложениот протокол обезбедува валиден метод за генерирање и карактеризирање на атеросклероза кај глувци; Ова може да ги следи раните фази на болеста и резултатите од терапевтската интервенција и рехабилитација при атеросклероза.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.