Индукција на исхемичен мозочен удар и исхемија-реперфузија кај глувци со употреба на оклузија на средната артерија

Вовед

Студијата за кардиоваскуларни болести како мозочен удар се заснова на употреба на модели in vivo. Со цел да се разберат можните ефекти на исхемија, токсичност на лекови и/или третман, постои потреба да се користи соодветен, стандардизиран, сигурен и репродуктивен модел на болеста што овозможува компаративни студии помеѓу групите за третман. Во овој ракопис, ние користиме глувци поради достапноста на голем број на трансгени глувци и стандардизирани модели за проценка. Развиени се резултати за да се проценат моторните и бихејвиоралните дефицити по експерименталниот исхемичен мозочен удар и по закрепнувањето беа развиени 1, 2.

Неколку модели на исхемичен мозочен удар се достапни, како што се целосна глобална церебрална исхемија, нецелосна глобална исхемија, мултифокална церебрална исхемија и фокална церебрална исхемија. Последната група е исто така категорија мозочен удар најчеста кај пациентите. Поголемиот дел од пресретта е инициран со формирање на емболична или тромботска оклузија на или во близина на средната церебрална артерија (МЦА). Наспроти позадината на овие параметри, моделот ја имитира болеста етиологија на мозочен удар и ги прави добиените резултати многу релевантни 3. Како и да е, преводот на откритија од животински модели до третман на болести кај луѓе се покажа како тежок. Досега е одобрена само употреба на активирач на плазминоген во тромболитичко ткиво за третман на акутен исхемичен мозочен удар 4.

Меѓу моделите на фокална церебрална исхемија во глувчето, моделот на мозочен удар на церебрална задна циркулација и моделот на тромбоза на церебрална вена се многу инвазивни, намалувајќи ја нивната применливост и ограничувајќи го опсегот на анализи што може да се извршат. Сепак, други техники, како што се емболичен модел, модел на фотромбоза, модел на мозочен удар предизвикан од ендотелин-1 и модел на затворање на церебрална артерија (MCAO) на интралуминален конци, се достапни за употреба без такви ограничувања. Моделот MCAO е техника опишана во овој протокол. Обезбедува сигурен метод за поттикнување на фокална церебрална исхемија, кој може лесно да се рефуртионира и да се изврши на висок начин на пропусност. Постојат два пристапа кон овој модел, имено методите Зеа-Лонга и Коизуми. Тие се разликуваат донекаде во начинот на воведување на оклузискиот конци во васкулатурата. Во техниката Zea Longa, конецот се вметнува низ надворешната каротидна артерија 5. Техниката презентирана овде е модифицирана од постапката Коизуми во која се става затварачка конци преку заедничката каротидна артерија 6.

Моделот MCAO е успешно применет за да се проценат различните настани што се случуваат при исхемичен мозочен удар. По реперфузија, може да се забележи церебрален едем заедно со распаѓање на крвно-мозочната бариера. Врвната нервна смрт обично се забележува на 24 часа; Сепак, може да се врати на почетното ниво по 7 дена 7. Кај луѓето, полот и возраста се важни варијабли во одредувањето на резултатите од мозочен удар; ова е забележано и кај глувци и стаорци 8, ​​9, 10. Неколку публикации го покажаа моделот MCAO кои користеле ефикасност на третманот 11, 12, 13, 14.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Сите постапки беа одобрени од Комитетот за грижа и употреба на животни на Универзитетот во Мајами (IACUC) во согласност со упатствата на Националниот институт за здравство (NIH). Потребна е употреба во стерилна опрема и асептички техники.

1. Подгответе шиење на оклузијата

  1. Користете конци со дијаметар од 0,21 mm за глувци помеѓу 20-25 g и 0,23 mm за глувци помеѓу 25-35 g телесна тежина. Изборот на видот на конците за постапката МЦАО се заснова на тежината на животното.
  2. Со сребрено пенкало, обележете го конци почнувајќи од 9 mm од врвот обложен со силикон. Ова ќе служи како водич за должината на инсталацијата.

2. Подготовка за операција

3. Дисекција на заедничката каротидна артерија и внатрешно/надворешно разгранување

4. Подготовка на ЦЦА за вметнување на конците на МЦАО

  1. Ставете три сегменти од најлонска нишка со должина од околу 4 инчи под CCA. Бидете сигурни дека ЦЦА не е извртена, бидејќи тоа драстично ќе го отежне вметнувањето на конците.
  2. На најниската можна точка, врзете го долниот спој во постојан јазол.
  3. Врзете го горниот спој веднаш под раскрсницата ICA/ECA со помош на отстранлив јазол за лизгање.
  4. Врзете го средниот спој користејќи отстранлив јазол за трчање, но држете го широко отворен. Важно е да оставите многу простор бидејќи тоа нема да спречи вметнување на цвест.
  5. Со ножици за пружина со микродесекција, направете засек во CCA помеѓу долните и средните конци. Направете засек од 0,2 мм во близина на долниот спој.

5. Оклузија на средната церебрална артерија

6. Затворање на инцизии и постоперативна нега

  1. Анестетизирајте го животното повторно (следете ги упатствата во 2.1) и отстранете ги конците за затворање на раните.
  2. Користејќи форцепс и сепаратори на ткива, повторно отворете го засекот и изложете го CCA.
  3. Внимателно го отстранувате горниот спој и нежно го повлекувате спојот MCAO додека силиконскиот слој не е во средината на јазолот.
  4. Повторете го горенаведениот јазол на конците за да спречите крв да тече низ конците (не мора да биде лизгачки јазол).
  5. Внимателно олабавете го средниот јазол и повлечете ја конците покрај горниот јазол, но држете го во рамките на ЦЦА.
  6. Цврсто затворете ја артеријата на горниот јазол за да го блокирате протокот на крв.
  7. Целосно повлечете ја конците MCAO и цврсто затворете го средниот јазол.
  8. Конците на МЦАО може да се користат повеќе пати. По секоја употреба, нежно исчистете ја конците во 70% етанол за да ги отстраните загадувачите (на пример, крв или ткиво) со стерилна газа. После тоа, ставете го конци во вреќа за стерилизација и стерилизирајте ја.
  9. Повторете ги чекорите 6.1-6.4 и следете го закрепнувањето на животните.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Во прилог на проучување на волуменот на мозочен удар, имунофлуоресценцијата може да се изврши за различни цели, како што е протеин-2 (MAP2) поврзан со микротубули за оштетување на невроните (3А) или глијален фибриларен кисел протеин (GFAP) за астроглиоза (3Б). Ваквите анализи дополнително овозможуваат анализа на прогресијата и закрепнувањето на мозочниот удар, како и на другите процеси вклучени во оштетување и поправка на ткивото на мозочен удар.

мозочен
Илустрација 1: ронг> Шематски приказ на мозочната артериска физиологија. Пренесете ги приходите од вметнување на МЦАО од заедничката каротидна артерија (ЦЦА) до областа на оклузија означена со сина боја. (:;: Среден цвест; БС: долен цвест МС горниот цвест ТС) Хируршката област е на долниот крај на фигурата (овална форма) и поставувањето на цвест е означено со црни линии. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

исхемичен
Слика 2: ТТЦ - Боење на делови од мозок. Горниот панел претставува типично боење по наместеното вметнување. 90 минути или 24 часа реперфузија на средни и долни плочи се добиени по 60-минутно следење на МЦАО. Скалата е 1 мм.

3 "src ="/датотеки/ftp_upload/54805/54805fig3.jpg "/>Слика 3: Боење на имунофлуоресценција по мозочен удар на мозокот на глувчето. По 60-минутна оклузија, мозокот се береше 23 часа и се обработуваше за репорфузија на крио-сечење. Со антитела против MAP2 (горе) и GFAP (долу) се анализираше ткивото за повреди на невроните и астроглиоза или лажна (лева полиња) или 90 мин мозоци за исхемија-реперфузија (десни полиња). Презентираните слики се земени од повеќе слики комбинирани со конфокална микроскопија со употреба на 10X цел. Скалата е 1 мм. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

Табела 1. Двор, за проценка на глувчето - Состојба и невродефицит по мозочен удар на исхемија. Прилагодено од 1, 2.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Во зависност од искуството на корисникот, овој метод може да се користи на голем начин на пропусност за испитување на голема група животни. Статистичкото значење на студиите врз животни зависи од употребата на доволен број субјекти помеѓу групите за третман и покрај препознавањето на суштинските разлики помеѓу експерименталните животни. Презентираниот протокол овозможува вакви студии при тесно создавање на делови од процесот на болеста.

Предноста на техниката MCAO е што иако вклучува некои хируршки зафати, не се потребни многу инвазивни процедури, како во моделот на краниотомија. Покрај тоа, тој е многу репродуцирачки и реперфузијата е високо контролирана, што не е можно со моделите на ендотелин-1 или емболичен мозочен удар. Техниката го имитира процесот на исхемичен мозочен удар кај луѓето и произведува повреди карактеристични за ткивата што се гледаат кај луѓето, што не е случај со моделот на фототромбоза. Во споредба со другите објавени техники, постапката MCAO нема да бара каутеризација на ECA. Ова е предност бидејќи може да се комбинира со нашиот модел на инфузија ICA за да се испорача терапевтски агенси на погодената хемисфера по индукција на мозочен удар 23, 24, 25.

Покрај анализата на ткивото, однесувањето на животните може да се следи долги за да се процени сериозноста и закрепнувањето на мозочниот удар. Ова може да помогне во споредување на опоравувањето помеѓу различните групи на третман. Развиени се неколку пристапи за проценка на однесувањето. Едноставна скала од 5 точки може да се користи за да се оцени невролошкиот дефицит по мозочен удар (0: нема дефицит на однесување; 1: нема контралатерално продолжување на предната нога; 2: кружење од спротивната страна на инфарктот; 3: стапици од спротивната страна на инфарктот; 4: Ниско ниво на свест и спонтано движење) 5. Покрај тоа, може да се изврши длабинска анализа на состојбата и однесувањето на животното за да се оцени закрепнувањето како 2 во Табела 1 1 опишан.

Презентираната хируршка процедура користи механичка процедура за индукција на мозочен удар, што во студиите за подложност на мозочен удар ја ограничува употребата на оваа техника и/или патогени микроорганизми. Сепак, овој протокол може да биде неверојатно корисен при анализа на сериозноста на мозочниот удар, неговите стратегии за избегнување или ограничување, отежнувачки фактори и можни терапевтски приоди по мозочен удар. Споредбата помеѓу групите за третман може да помогне во идентификување на потенцијални третмани кои можат да го минимизираат оштетувањето од мозочен удар или забрзано закрепнување. Навистина, помагањето на пациентите со мозочен удар да го подобрат закрепнувањето ќе биде од голема важност.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.