Инхибицијата на хемиканалите на конексин го олеснува стеатохепатитисот без алкохол кај глувците

предмети

апстрактен

вовед

Безалкохолно заболување на масен црн дроб (НАФЛД) е најчестото хронично заболување на црниот дроб со проценета распространетост од 25% ширум светот 1. NAFLD претставува спектар на болести кои се движат од хепатална стеатоза до стеатохепатитис без алкохол (NASH), фиброза на црниот дроб, цироза на црниот дроб и конечно хепатоцелуларен карцином 2. Стеатозата на црниот дроб може да биде предизвикана од зголемен прилив на масни киселини од диета со висока содржина на маснотии, отпорност на инсулин, лекови и генетски фактори. Како таква, стеатозата се карактеризира со акумулација на липидни капки базирани на триглицерид во цитозолот на хепатоцитите 3. Хепаталната стеатоза може да се развие во NASH како одговор на голем број предизвикувачи како што се воспалителни цитокини, адипокини, реактивни видови кислород и ендоплазматски стрес на мрежата 4 .

Резултати

Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 врз активноста на раскрсницата и одговори на полуканални коннексини

TAT-Gap24 и TAT-Gap19 имитираат аминокиселинска секвенца во интрацелуларната јамка во регионот Cx32 и Cx43, соодветно. Откриено е дека Gap19 се врзува за C-терминалниот регион Cx43, со што се крши интеракцијата помеѓу интрацелуларната јамка и C-терминалната област, што пак го инхибира отворот на полуканалот Cx43 12. Се верува дека сличен механизам е основа на дејствата на TAT-Gap24 на полуканалите Cx32. За да се процени специфичноста на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 за блокирање на полуканалите на Cx, но не и на јазличките споеви, беше извршено обновување на флуоресценцијата по анализа на фото-белење (FRAP) во култури на хепатоцити кај стаорци (n = 4, N = 4) . Особено, хепатоцитите на стаорци биле изложени на 20 μm TAT-Gap19, 20 μM TAT-Gap24, 50 μM карбеноксолон (CBX), познат инхибитор на Cx каналите 17, или контрола на возилото 24 часа и 48 часа, 24 часа по обложувањето. Кога се користи со 20 μM, TAT-Gap24 и TAT-Gap19 не предизвикаат цитотоксичност во хепатоцитните култури на примарниот стаорец (дополнителен 1). CBX го намали обновувањето на флуоресценцијата по 24 часа (стр

хемиканалите

конексин

Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 врз експресијата на протеините на конексин во црниот дроб. После 8 недели на CHFD, хируршки беше вградена осмотска пумпа во абдоминалната празнина што обезбеди трајно ослободување на 1 mg/kg/ден TAT-Gap24 (n = 11) или TAT-Gap19 (n = 12) или солен раствор (n =) 14 ) за дополнителни 2 недели додека диетата продолжува. Анализа на имуноблот на Cx26 (21 kDa), Cx32 (27 kDa) и Cx43 (43 kDa) по одвојувањето и размачкувањето, по што резултатите се нормализираа до топол протеински товар. Сликите за закрпи се отсечени. Дамките со целосна должина се прикажани во Дополнителен 4. Податоците се изразуваат како средства ± СЕМ.

Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 врз биометриските параметри, хистологијата на црниот дроб и серумските трансаминази

Релативната тежина на маснотиите се зголеми за повеќе од двојно и беше во глувци кои се хранат со CHFD (n = 14) во споредба со глувци кои се хранат со ND (стр. 22. Сите резултати беа 0 во групата хранат со ND (n = 10) и имаше еден Зголемување на резултатот на стеатоза (стр

инхибицијата

Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 врз биометриските параметри и хистологијата на црниот дроб во НАШ. После 8 недели на CHFD, осмотска пумпа беше всадена хируршки во абдоминалната празнина, обезбедувајќи одржливо ослободување од 1 mg/kg/ден TAT-Gap24 (n = 11) или TAT-Gap19 (n = 12) или солен раствор (n =) 14 ) уште 2 недели при продолжување на диетата. а ) Тело, маснотии и црн дроб на глувци и релативни тежини на црниот дроб и маснотиите. ( б ) Стеатоза, лобуларно воспаление, формирање балони и НАС резултат базиран на хематоксилин-еозин боење на црниот дроб ткиво на групата НД (прв панел), солена група (втор панел), ТАТ-Гап24 (трет панел) и ТАТ-Гап19 група (четврто Панел) панел). Податоците се претставени како средни EM SEM со * стр

хемиканалите

Ефекти на TAT-Gap24 и TAT-Gap19 врз воспалителни цитокини и оксидативен стрес во NASH. После 8 недели на CHFD, осмотска пумпа беше всадена хируршки во абдоминалната празнина, обезбедувајќи одржливо ослободување од 1 mg/kg/ден TAT-Gap24 (n = 11) или TAT-Gap19 (n = 12) или солен раствор (n =) 14 ) уште 2 недели при продолжување на диетата. ( а ) Нивоа на IFN-γ, IL-6, IL-1β, TNF-α и IL-10 во црнодробното ткиво и серумот. ( б ) Активност на SOD, GR, GPx и каталазата во ткивото на црниот дроб. Податоците се претставени како средни ± SEM со * стр 27. Ова исто така важи и за глутатион редуктаза (ГР), глутатион пероксидаза (ГПх) и каталаза како антиоксидантни ензими 28. Всушност, глувците и луѓето пациенти со НАШ имаат намалено ниво на глутатион, СОД и активности на каталаза 27, 29. Интересно, кај црниот дроб на глувци кои биле хранети со CHFD (n = 14), откриен е повисок GPx (p 30,). Слични ефекти (p 31. За антигенот на лимфоцитите (LY) 86 не се пронајдени разлики на нивото на протеините (6 и дополнителни 5).

хемиканалите

2, 5 μ М 12 се врзува, овозможувајќи да се фати и задржи пептидот интрацелуларно. Се верува дека Gap24 реагира слично на Cx32 18. И глувците NASH третирани со TAT-Gap24 и третираните со TAT-Gap19 покажаа намалено ниво на триглицериди, холестерол, IL-1β и поголеми количини на СОД во ткивото на црниот дроб. Покрај тоа, TAT-Gap19 исто така ги намали нивоата на ALT и TNF-α, додека глувците третирани со TAT-Gap24 имаа пониски нивоа на IFN-γ. - и имаше нивоа на IL-6. Сепак, треба да се нагласи дека неспецифичните ефекти како такви како резултат на недостаток на контрола на пржени пептиди во јајца не можат да бидат целосно исклучени од оваа студија. Нивоата на активност на СОД, каталаза, GR и GPx обично се намалуваат за време на NASH 27, 29 бидејќи прекумерните произведени реактивни видови кислород можат директно да ги разложат антиоксидантните молекули и да ги инхибираат активностите на антиоксидантните ензими 44. Бидејќи каталазата, GPx и SOD ја вршат својата ензимска активност во тесна врска едни со други 44, намалувањето на активноста на каталазата и GPx може да рефлектира компензациски механизам за зголемено ниво на активност на SOD.

Сумирајќи, инхибицијата на полуканалите на Cx може да отвори перспективи за воспоставување на нови терапевтски стратегии за третман на НАС.

материјали и методи

Animивотни и третман

Изолација и одгледување на хепатоцити

Машки стаорци Спраге-Доули (лаборатории на реката Чарлс, Белгија) беа сместени под контролирани услови на животната средина со слободен пристап до храна и вода. Хепатоцитите беа изолирани со употреба на процедура на перфузија на колагеназа во два чекора, вклучително и прочистување со сериска диференцијална центрифугација, а одржливоста на клетките беше проценета со исклучување на трипан сина боја. Одржливи (≥ 85%) хепатоцити со густина од 0,56 × 10 5 клетки на см 2 во Вилијам Медиум Е (Инвитроген, САД), дополнети со 7 ng/ml глукагон, 292 mg/ml Л-глутамин, антибиотици ( 7, 33 IU), позлатен натриум бензилпеницилин, 50 уг/мл канамицин моносулфат, 10 уг/мл натриум амфицилин и 50 уг/мл стрептомицин сулфат) и 10% фетален серум говеда. По 4 часа, 24 часа и 48 часа, медиумот на клеточна култура беше отстранет и заменет со медиум без серум кој содржи 25 .mu. g/ml хидрокортизон натриум хемисуцинат и 0,5. беше дополнет g/ml инсулин. Постапките за стаорци за домување, како и изолацијата и одгледувањето на хепатоцитите беа одобрени од Етичкиот комитет за експерименти врз животни на Универзитетот Врије во Брисел (проект број 14-210-1), а сите животни беа тестирани според критериумите на Водичот за нега и употреба на лабораториски животни ".

Обнова на флуоресценција по фото-белење

За FRAP анализа 24 часа по клеточното обложување, култивираните хепатоцити на стаорци биле изложени на 50 μM CBX, 20 μM TAT-Gap24, 20 μM TAT-Gap19 или контрола на возилото 30 минути, 24 часа и 48 часа. Анализата на ФРАП е извршена како што е претходно опишано 37. Флуоресценцијата во изветвената ќелија беше изразена како процент закрепнување во однос на почетното ниво непосредно пред фото-белење. Слична анализа беше извршена и на клетките отстранети од избелената област за да се следи фото-белењето надвор од целната област. Вредностите за обновување за секој експеримент беа нормализирани во соодветните услови за контрола на возилото. Покрај тоа, вредностите на Y 0, плато, тау, полувреме и мобилни фракции се пресметани по нелинеарно прилагодување на кривата.

Мерење на екстрацелуларниот аденозин трифосфат

Екстрацелуларниот ослободен АТП беше измерен со употреба на комерцијален комплет за анализа луциферин/луцифераза (Сигма, САД) како што е претходно опишано 37. TAT-Gap24 и TAT-Gap19 најпрво беа инкубирани на 37 ° C за 0 минути, 6 дена или 20 дена во класичен инкубатор (Galaxy 170S, Brу Бранзвик, Германија). Примарните култури на хепатоцити кај стаорци потоа беа изложени на 20 μm TAT-Gap24, 20 μM TAT-Gap19, 50 μM CBX или контрола на возилото 30 минути. Овие експерименти беа извршени 24 часа по изолацијата на примарните хепатоцити.

Хистопатолошки преглед

Примероците на ткивото на црниот дроб беа фиксирани во 10% формалин со фосфат-пуфер за 24 часа и беа вградени во парафински восок. Примероците беа во 5. М-делници сечени и обоени со хематоксилин-еозин за да се процени стеатозата, хепатоцелуларниот балон, воспаление на лобулите и НАС, како што е претходно опишано 22. Степенот на стеатоза е оценет со користење на следнава скала од 4 точки, стеатоза од 0 степен, со вклучување на 66% од хепатоцитите. Воспалението на лобулите исто така беше оценето на скала од 4 точки, имено одделение 0, без фокуси; Одделение 1, помалку од 2 стада на поле × 20; Одделение 2, 2 до 4 стада на поле × 20; Одделение 3, повеќе од 4 стада на поле × 20. Формацијата на балонот на хепатоцитите беше оценета на скала од 3 точки: 0, ниту еден; 1, некои балонски ќелии; 2, какви било/испакнати балонски ќелии. За НАС, карактеристиките на стеатоза, лобуларно воспаление и балон на хепатоцити беа комбинирани со вредности од 0 до 8.

Анализа на серумски аминотрансаминази, серумски триглицериди во црниот дроб и холестерол

Липидите на црниот дроб беа извлечени со хлороформ/метанол. Особено, ткивото на црниот дроб се хомогенизираше во 1 ml раствор на хлороформ/метанол од 2: 1 и се тресеше на 22 ° C за 1 час во Термомиксер (Епендорф, Германија). Примероците беа центрифугирани на 5000 x g 10 минути, по што супернантот беше отстранет. Следно, 200 .mu. Додадена е дестилирана вода и примероците беа центрифугирани на 8.000 х g за 5 минути. Долната фаза се исуши на 37 ° C. преку ноќ. Пред анализата, липидите се растворија во 400 μl бутанол (Сигма, САД). АЛТ, АСТ, триглицеридите и холестеролот се измерени со хемиски анализатор (Лабмакс 240, Лабтест, Бразил). Резултатите беа изразени во IU/l за AST и ALT, mg/dl за серумски триглицериди и холестерол и μg/mg за триглицериди во црниот дроб и холестерол.

Анализа на воспалителни цитокини на црниот дроб

Ткивото на црниот дроб беше хомогенизирано во пуфер за лиза со инхибитори на протеаза (Рош, Германија). Хомогенатите беа центрифугирани на 14,000 x g за 15 минути на 4 ° C, а концентрациите на протеини во супертанти беа утврдени со методот Бредфорд 62 со употреба на комерцијален комплет (Био-Рад, САД) со серумски албумин од говеда како стандард. Комплетите ЕЛИСА беа користени за мерење на нивото на IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ и TNF-α (BD Biosciences, САД) во црниот дроб 63.

Анализа на антиоксидантни ензими на црниот дроб

Анализа на целиот транскриптом

Анализа на имуноблот

Имуноблот-анализата на ткивото на црниот дроб е извршена како што е претходно опишано 63. Мембраните на нитроцелулоза/PVDF беа инкубирани преку ноќ на 4 ° C со примарно антитело насочено кон Cx26 (1/1000 разредување), Cx32 (1/1000 разредување), Cx43 (1/1000 разредување), CD36 (1/250 разредување), NADPH оксидаза (1/250 разредување) и LY86 (1/500 разредување) (Сигма, Белгија) проследено со инкубација 1 час на собна температура со соодветно секундарно антитело (1/1000 разредување за Cx26, Cx32 и Cx43; 1/500 разредување за CD36, NADPH оксидаза и LY86) (Дако, Данска). Дензитометриската анализа беше извршена со употреба на софтвер Image Lab 5.0 (Био-Рад, САД). За цели на полу-квантификација, сигналите се нормализираа против вкупниот протеин, мерено со гелови без дамки и се изразија како релативни измени во споредба со животни кои се хранат со НД.

Статистичка анализа

Бројот на биолошки (n) и технички (N) повторувања за секоја анализа е различен и е наведен во дискусијата за резултатите. Сите податоци беа изразени како просечна ± стандардна грешка на просекот (SEM). Резултатите беа статистички обработени со еднонасочна анализа на варијанса со пост хок корекција на Бонферони. Сите податоци беа обработени со помош на софтвер GraphPad Prism6, со вредности на веројатност (р) помали од 0,05 се сметаат за значајни.

благодарноста

Авторите сакаат да им се заблагодарат на Диња Де Вин, Тинеке Ванхалевин, Пол Клас и Стивен Брансон за нивната посветена техничка работа. Оваа работа беше финансиски поддржана од грантовите на Универзитетот во Сао Паоло-Бразил, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (грант за FAPESP SPEC 2013/50420-6 и 2016/16182-9), Европски совет за истражување ( РКЕ започнат со грант 335476), Фондот за научно истражување-Фландрија (грантови на ФВО G009514N и G010214N) и универзитетска болница на универзитетот Врије Брисел-Белгија („Вили Гептс фондс“ UZ-VUB).

Дополнителен електронски материјал

Дополнителни информации

Забелешки

Со поднесување коментар, вие се согласувате со нашите услови за користење и упатствата за заедницата. Ако најдете нешто навредливо или што не е во согласност со нашите услови или упатства, означете го како несоодветно.