Капацитет на диференцијација на протоколот на човечки аортни периваскуларни масни масни клетки (во превод)
Резиме
Целта на овој протокол е да се тестира способноста на прогениторните клетки добиени од човечко периваскуларно масно ткиво да се разликуваат во повеќе лози на клетката. Диференцијацијата се спореди со мезенхималните матични клетки од човечката коскена срцевина, за кои се знае дека се разликуваат во лоза на маснотии, остеоцити и рскавични клетки.
Апстракт
Вовед
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
Употребата на човечки ткива во оваа студија беше оценета и одобрена од Институционалниот одбор за преглед на Медицинскиот центар во Мејн, а целиот персонал доби соодветна обука пред експериментите.
2. Протокол 1: Култура на човечки PVAT клетки од руптура на васкуларните строма
Забелешка: PVAT се ресецира од местото на графтот анастомоза во асцендентната аорта кај анестезиран пациент со ангиопластика на коронарна бајпас. Аортниот PVAT се става во конусен 15 ml со 10 мл мраз ладно високо ниво на гликоза DMEM-F12 и се пренесува во лабораторијата од операционата сала во рок од 2 часа по ресекцијата. Аортниот PVAT се исфрла од ткивото за време на бајпас процедурите и се чува како истражување на нехумани субјекти од одделот за внатрешна ревизија на Медицинскиот центар Мејн.
-
Овој протокол е за А.
500 мг парче човечки PVAT (приближно 3 x 1 x 0,5 cm 3). Префрлете свеж човечки PVAT од ДМЕМ во 50 мл конусна цевка која содржи 25 мл раствор на антибиотици. Инкубирајте со карциген 20 мин на 4 ° C Додека PVAT е во раствор на антибиотици, одмрзнете дел од пуферот за дисоцијација на 37 ° C. Додадете 5 ml дисасоцијан пуфер 50 μL 100 X антибиотик/антифунгален раствор и стерилизирајте со филтер за шприц 0,22 µm. 1, исто така, додадете 1 ml раствор на желатин од плоча со 24 бунари. Во хауба со ламинарен проток, користете стерилни пинцети и ножици за да го пренесете PVAT од растворот на антибиотици во стерилен сад со петри. Во ткивото додадете 1 мл претходно загреан пуфер за дисоцијација и ситно исечкајте го целото ткиво во кашеста маса (без парче поголемо од
Додадете 1 ml свеж медиум за култура и дистрибуирајте 500 μL, 2 бунари од плоча со 24 бунари, секој со 500 μL медиум за раст и 25 ng FGF2.
3. Протокол 2: Културни колонии на ЦСЦ во човечка коскена срцевина
Забелешка: MSC на човечка коскена срцевина изолиран како што е опишано 8 и се чува како залихи на рано поминување во замрзнат медиум за замрзнување (70% FBS, 20% базален DMEM и 10% DMSO)
100 000 клетки/ml во течност N2.
- Брзо одмрзнете шишенце од коскената срцевина MSC од течноста N2 во водена бања и плоча од 37 ° C до бунар од 6-бунарска културна плоча со 3 ml медиум за раст на MSC и инкубирајте преку ноќ на 37 ° C и 5% CO2.
- Следниот ден, аспирирајте медиум за култура на MSC и измијте ги клетките 3X во 2 ml HBSS. На 100% слив, аспирирајте медиум за раст и измијте ги клетките 3X во 2 ml HBSS. Додадете 500 μL/бунар раствор за одделување на клетки и инкубирајте на 37 ° C и 5% CO2 за 5 мин. Допрете ја плочата за да се осигурате дека сите клетки се раселени и содржината во плоча со 6 бунари со 2 mL медиуми за раст на MSC рамномерно во 2 бунари да се дистрибуираат.
- Проширете во хумана коскена срцевина и добиен PVC MSC паралелно за приближно 5-7 пасуси или додека не се достигнат доволни количини за тестирање.
4. Протокол 3: Плоча и индуцирајте адипогени, остеогени и хондрогени линии
-
Соодветниот број на плочи на коскена срцевина и PVAT клетки се обновува по бунар на плоча од 12 бунари и соодветно се реплицира за секоја експериментална состојба. За адипогени и остеогени состојби,
5. Протокол бр. 4: Култура на адипогени, остеогени и хондрогени линии за 14 дена
6. Протокол бр. 5: боење на адипогената состојба со црвено масло O
7. Протокол 6: боење на остеогената состојба со ализарин црвена боја
- Извадете ја целата течност од секој бунар. Додадете соодветни количини на 2% раствор на дамки од ализарин на секоја бунар (1,5 ml на бунар за плоча од 12 бунари) и нежно навалете ја плочата од едната на другата страна додека растворот не го покрие дното на бунарот.
- Инкубирајте 15 мин на собна температура. Отстранете ја ализаринската црвена боја од бунарот. Исплакнете го секое добро четири пати со дестилиран H2O, внимавајте да не ги поместите нежно кристалите на калциум. нека се исуши.
8. Протокол 7: Боење на хондрогена состојба со Масон трихром
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
Изолација на васкуларниот дел на стромалните клетки од човечки PVAT
Слика 1А покажува шематски приказ на анатомскиот регион којшто е утврден како надминување на PVAT на асцендентната аорта. Групите на пациенти при операција на коронарна бајпас, овие примероци добиени од 6-те беа претходно опишани - Слика 1б покажува пример за PVAT на човекот добиен по операцијата. илустрација 1 покажува репрезентативен дел од ткаенината PVAT обоена со дамка Масон Трихром. илустрација 1 е микрограф на фазен договор што покажува популација на PVAT добиени стромални клетки за време на фазата на експанзија пред диференцијацијата. Клетките може да се прошират и замрзнат за идна употреба. Клетките обично се со густина од 2,5 x 10 5 клетки/ml во медиум кој се состои од 70% замрзнат FBS, 20% базален (без антибиотици) DMEM-F12 и 10% DMSO во изопропанол комора. 80 ° C за 24 часа и се пресели во течна фаза на течен замрзнувач N2 за долгорочно складирање.
Адипогена диференцијација
MSC паралелно со човечката коскена срцевина (Слика 2АБ.) и прогениторни клетки добиени од PVAT (Слика 2)Д.) спроведени се студии. Левите панели на слика 2 покажуваат индуцирана состојба каде што не е евидентна акумулација на липиди. Точните плочи покажуваат клетки со диференцијација на адипоцитите и боење на неутрални липиди со црвено масло O. Додека степенот на диференцијација кај човечката аортна валвула е поцврст во клетките добиени од PVAT, двата извори ја покажаа човечката клетка способноста да се разликува во правец на адипогената лоза.
Остеогена диференцијација
Протоколот за остеогена диференцијација беше применет на MSC добиен од човечка коскена срцевина (Слика 3А)-Ц.) и клетки собрани од PVAT (слика 3D- Ф.) се користи. Не-индуцирани клетки (Слика 3АД.) не обојувајте црвена боја со ализарин. Според протоколот за остеогена диференцијација, човечкиот MSC развил калцифицирани нодули кои биле обоени во црвена боја со ализарин (слика 3б- В.), додека клетките добиени од човечки аортни PVAT не (Слика 3Е-Ф.) Овие податоци сугерираат дека нашата подготовка на клетки од прекин на стромална васкуларна состојба на човечки PVAT нема бројни предци со можност да се подложат на остеогенеза. Во зависност од студијата и временскиот тек на диференцијација, препорачливо е да се следат стандардните точки со откривање на молекуларни маркери кои ја дефинираат зафатеноста на линијата што формира коски (на пр. RUNX2, Остерикс, алкална фосфатаза) или остеобласти (остеопонтин, остеокалцин, алкална фосфатаза, БАП1).
Хондрогена диференцијација
Клетки и од MSC на човечката коскена срцевина (Слика 4А) изведен и човечки PVAT (Слика 4б) покажуваат карактеристики карактеристични за хондрогената диференцијација, со обилна акумулација на колаген во микромасата. Микромасите формирани од MSC на човечката коскена срцевина и клетките добиени од аортна PVAT, исто така, прикажаа изобилство акумулации на гликозаминогликани (сина), како што е наведено со боење на алкијанско сино (слика 4-Д., соодветно). Морфолошки, структурите биле слични на празнините со седење во шуплини создадени од таложење на колаген (Слика 4), Стрелки) околни клетки. Во зависност од студијата и временскиот тек на диференцијација, откривањето на одредени хондрогени маркери (агрекан, колаген тип II, остеонектин, Sox9) е корисно.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Дискусија
Матичните клетки на масното ткиво станаа фокус за апликации за регенеративна медицина, поради лесниот пристап и големиот број на клетки што можат да се изведат од масното ткиво 12, 13. Васкуларни клетки, воспалителни клетки, фибробласти, предипоцити и матични клетки на масното ткиво се васкуларниот дел на масното ткиво на стромалните клетки. Постојат разлики во популацијата на матични клетки засновани врз анатомската локација на масното депо и својствата на масните клетки 14. Што е најважно, матичните клетки добиени од масното ткиво се чини дека можат да се разликуваат не само во мезенхимални лози 15, туку и потенцијал да претпостават невронски 16, 17 и епидермални 18 судбини.
Бројни студии се фокусираат на матични/прогениторни клетки добиени од човечко поткожно бело масно ткиво, но неколку студии се осврнаа на својствата на прогениторните популации на PVAT. Неодамнешните студии изолираа клетки на адипоцити, прогениторни клетки од PVAT околните мезентерични садови или торакална аорта на стаорци. Додека овие популации CD34 +/CD140a + се разликуваат во адипоцити, можноста за цртање други лози не беше тестирана 19 .
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Откривање
Авторите не откриваат ништо.
Признанија
Ја препознаваме поддршката на Навигациското истражување во Меинскиот медицински центар за помош при добивање на клиничко ткиво и јадро на хистопатологија и хистоморфометрија (поддржано од 1P20GM121301, L. Liaw PI) на Медицинскиот центар за истражување во Мејн за сечење и боење. Ова дело беше поддржано од NIH Grant R01 HL141149 (L. Liaw).