Клеточни ефекти, механизми на дејствување и методи на откривање на тироидни хормони и нивни

Клеточни ефекти, механизми на дејствување и методи на откривање на тироидните хормони и нивните метаболити Дисертација за добивање на академски степен лекар rerum naturalium (д-р ре. Нат.) Во биологија доставена до Факултетот за животни науки на Универзитетот Хумболт во Берлин од трофологот на магистер на науки, Ина Лемхфул, претседател на Универзитетот Хумболт во Берлин, проф. Д-р. Јан Хендрик Олбертц декан на Факултетот за животни науки проф. Д-р. Ричард Луциус Рецензент: 1. Проф. Вернер Клоас 2. Проф. Јозеф Керле 3. Проф. Јенс Митаг Ден на усниот испит: 23.05.2015 г.

откривање

Содржина Содржина. I Список на кратенки. V Листа на бројки. X Список на табели. XI резиме. XII апстракт. XIII 1. Вовед. 1 1.1 Тироидната жлезда. 1 1.2 Тироидни хормони (ТХ). 1 1.2.1 Биосинтеза. 1 1.2.2 Ослободување и транспорт. 3 1.3 Оската на тироидната жлезда на хипоталамусот на хипофизата (ХПТ). 4 1.4 Метаболизам на тироидниот хормон. 4 1.4.1 Метаболизам на тироидниот хормон со деиодази. 4 1.4.2 Алтернативен метаболизам на ТХ. 6 1.4.3 Локални и системски ефекти на активен ТХ Т 3. 7 1.5 Важни ТХ метаболити 3.5 Т. 9 2 1.5.1 Локални и системски ефекти на 3,5 Т 2. 9 1.5.2 Транспорт во серум и во целни клетки . 10 1.5.3 TH рецептори на метаболит. 10 1.5.4 Методи за откривање на 3,5 Т 2. 11 1.6 Важни ТЕ метаболити 3 Т УТ. 12 1 1.6.1 Локални и системски ефекти од 3 Т 1 часот. 12 1.6.2 Транспорт во серумот и во целната клетка. 13 1.6.3 рецептори на метаболити TH. 13 1.6.4 Методи за откривање на метаболит. 14 1.7 Важен ТХ метаболити ТА 1 3 Тироцетна киселина. 14 2. Цел на работата. 17 2.1 Метод на откривање на метаболити на тироидните хормони. 17 2.2 Ефект на метаболити на тироидните хормони во моделот на клеточна култура. 17 3. Материјал. 18 3.1 Хемикалии. 18 3.2 Уреди. 18 јас

3.3 Потрошен материјал. 18 3.3.1 Колекции на реагенси. 18 3.3.2 Бафери и решенија. 19 3.4 Бази на податоци. 20 3.5 Софтвер. 20 4. Методи. 23 4.1 Молекуларни биолошки методи. 23 4.1.1 изолација на РНК со Тризол. 23 Синтеза на ЦДНА 4.1.2. 23 4.1.3 кпкр. 24 4.1.4 Буквари. 25 4.2 Протеински биохемиски методи. 28 4.2.1 принцип Брадфорд. 28 4.2.2 Имплементација на Брадфорд. 28 4.3 Клеточна култура. 29 4.3.1 Мирена панкреатична клетка MIN6. 29 4.3.2 Хумана хепатоцелуларна клеточна линија HepG2. 29 4.4 Анализи за цитотоксичност/одржливост на клетките. 29 4.4.1 Анализа на MTT Анализа на токсичност на зависни клетки од NADPH. 29 4.4.1 а) Принцип на анализата. 29 4.4.1 б) Имплементација. 30 4.4.2 Анализа на одржливост на АТП-клетките. 30 4.4.2 а) Принцип на анализата. 30 4.4.2 б) Имплементација. 30 4.5 Врзување на мобилното навлегување/површината на клетката од 3 T 1 AM. 30 4.6 Екстракција на клетки MIN6 за анализа на LC MS/MS. 31 4.7 Извлекување на суперинатанти на MIN6 клеточна култура за анализа на LC MS/MS. 32 4.8 LC MS/MS параметри. 32 4.8.1 AbSciex 4000 анализа на лизати на клетки во културата. 32 4.8.2 AbSciex 6500 анализа на суперинатални клетки. 34 4.9 Гликозно-стимулирано лачење на инсулин (ГСИС). 36 4.10 Анализа на обрт на енергија специфична за подлогата со Seahorse XF биоанализатор. 36 4.10.1 Принцип на мерење. 36 4.10.1 а) Митохондријално дишење. 37 4.10.1 б) Гликолиза/метаболизам на подлогата. 39 II

Список на кратенки C степени Целзиусови μ микрограми микрограми μl микролитар μm микромоларни 2 DG 2 деоксиглукоза 3 T 1 AM 3 јодотиронамин AADC ароматични L аминокиселинска декарбоксилаза Слика Сл. Аденилат циклаза Адра 2α адренергичен рецептор Маса означувач BSA говедски серумски албумини cDNA комплементарна ДНК CLIA Chemilumineszenez имунолошка проба Ct циклус на treshhold COX цитохром c оксидаза DC декарбоксилаза Dehal Dehalogenase DEPC Diethylpyrocarbonate Dio Deiodase долази 3,5 Diiodtyrosine DMEM Dubelcco s модификуван EagleDesulfonX ДНК NPHelcco анхидрид anaDyribulfonX ДНК NPHelcco anaDyloxy anaDySulfonX ДНК NADyribulfone и нА Двоен оксидаза ECAR стапка на екстрацелуларна ацидификација V

ЕДИС ЕЛИСА ЕРК ЕСТ ФБС FCCP етил 3 (3 диметиламинопропил) карбодиимид-ензим-поврзан со имуно-анализа екстрацелуларно регулирана киназа изразена секвенца ознаки фетален говедски серум карбонил цијанид p трифлуорометоксифенилхидризон ft 3/ft 4 слободен/не gC gF gC gF не gF gA h H 2 OH 2 O 2 HbA 1 c HPLC HPRT HPT оска HRP ицв Иг i.p. Ипро и.в. kda KRBH Lat/LAT LCB LC MS/MS LDL m M mab брза перформанси течна хроматографија напред Забрзување против глувче IgG, Fc специфичен и биотинилиран G-протеин-придружен рецептор гликоза-стимулиран секреција на инсулин час водород пероксид гликохемоглобин течност хроматографија хипоксантихуксанхонтекс хипокситалхиокс хипокситалхиокс хиперсинхонтекс хипоценталунс хипоцентол хипотекс генсал интраперитонеален ипрониазид интравенски килодалтон Кребс Рингер ХЕПЕС пуфер L-тип аминокиселински транспортер ниска вкрстена тампон течна хроматографија споена тандемска масена спектрометрија со мала густина липопротеин милиоларно моноклонално антитело VI

MAPK Mct/MCT мин. MIN6 СО MTT mrna n NA NADH NADPH NaN 3 ND NEAA ng NIS nm nm NQ ns Ntcp/NTCP NTI Oatp/OATP OCR ON p pab PAI PB PBS PBST PCR PI3K POAF qpcr Митоген активиран протеин киназа линија глушец Мобилен 3 monoiodo тирозин тетразолиум сол messengerrna нано не анализирани никотинамид аденин динуклеотид никотинамид аденин динуклеотид фосфат натриум азид не е детектирана не-есенцијални амино киселини Nanogram натриум јодид symporter нанометри nanomolar не измерени не е значајно Na + taurochlorygenate cotransporting полипептид безводен protochlorate фосфонат кислород phospholeptic анти-тироидна стапка organocomponent транспортирање на антитела во текот на тироидна стапка полицикличен антитело преку ноќ phosphoniferous оксигенација Солен раствор Фосфатен пуфер солен раствор со верижна реакција на Tween полимераза Фосфатидил инозитол 3 киназа постоперативна атријална (срцева) фибрилација квантитативно во реално време PCR VII

rev RIA RNA rpm RQ rt 3 s.c. SD SDS sec SHIP Slc/SLC SULT T 0 T 1 T 2 T 3 T 4 TA TAE TAM TAAR TBG TCA Tg TH TBME TPO TRα TRβ TRE TRH TSH обратна радиоимуноанализа Револуции на рибонуклеинска киселина/мин респираторен количник обратна 3,3,5 триод L тиронин поткожна тироидна натриумодецил сулфат втора студија за здравје во Померанија раствор на раствор на сулпотрансфераза тиронин 3/3 тиронин 3,5/3,3/3,5 диодин Л тиронин 3,3,5 тријод Л тиронин 3,3,5,5 тетрајодон Л тиронин/Тироксин Thyroacetic киселина Tris ацетат EDTA пуфер Thyronamine трагови амин поврзани рецептор Тироксин врзувачки глобулин трикарбоксилична киселина тироглобулин Thyronine, тироиден хормон-терц-бутил метил етер на тироидната пероксидаза на тироидната жлезда хормон на алфа рецепторот на тироидната жлезда хормон-рецептор 3/бета TH одговора елемент Тиреотропин-ослободувачки хормон 3/бета TH одговора елемент тиротропин-ослободувачки хормон 4/бета TH одговора протеин 4 тиротропин-ослободувачки хормон 4/бета-TH одговора протеин 4 тиротропин-ослободувачки хормон 4/бета-throid стимулирање на протеин 4 тиротропин-ослободувачки хормон 4/бета-TH одговора протеин Транстиретин VIII

VLDL вол% многу ниска густина липопротеин волумен% IX

Механизмот за транспорт во целната клетка е познат и активирањето на рамните мембрански рецептори допрва треба да се испитува. 16

Табела 2 Најчесто употребувани комплети за реагенси Комплет за реагенси Апсолутно qpcr SYBR зелена мешавина Анализа на протеини во боја концентрат на реагенс CellTiter Glo Анализа за одржливост на луминисцентни клетки RQ1 RNase free DNAse ImmunoPure MAb комплет изотипизација Инсулин (глушец) Комплет за анализа на протеини PIERCE EZ Link Plus активирана пероксидаза PIERCE SuperSignal ELISA Супстрат за максимална чувствителност RIA rt 3 Sepharose r Protein A Slide A Lyzer Dialysis касети 2K MWCO ТермоСкрипт Обратна Транскриптаза Тризол Производител Абгене (Епсом Ламбрат) WI, САД) Promega (Медисон, WI, САД) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, САД) DRG дијагностика (Марбург) Био Рад (Минхен) Candor Biosciences (Wangen) Thermo Scientific (Waltham, MA, САД) Thermo Scientific ( Валтем, М-р, САД) Термо Научен (Валтем, М-р, САД) ZenTech SA (Белгија) GE Healthcare (Freiburg) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, САД) Invitrogen (Карлсруе) Thermo Scientific (Валтем, М-р, САД) 3.4 Бази на податоци Табелата 4 ги прикажува сите користени системи за управување со податоци. 3.5 Софтверска табела 5 го сумира софтверот што се користи во оваа работа. 20-ти