Квантификација на хемотактичката активност на моноцитите In Vivo и карактеризација на крвниот моноцит

Резиме

Тука презентираме протокол за квантифицирање на хемотактичката активност на крвните моноцити во моделите на глувци за да се проценат ефектите на нутриционистичките, фармаколошките и генетските интервенции врз крвните моноцити и макрофагите добиени од денмонцити во моделите на глувци со моноцит-хемоатрактарен протеин-1 (MCP-1) - наполнети приклучоци за гел во вентилирана подземна мембрана.

Апстракт

Вовед

Протокол

Сите методи опишани во овој протокол се одобрени од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни на Медицинскиот факултет во Вејк Форест.

1. Подготовка на раствор добиен од основната мембрана намален со фактор за раст натоварен со MCP-1

ЗАБЕЛЕШКА: Ова е стерилна постапка.

2. Инјектирање на раствор добиен од подрумска мембрана

3. Берба на гел приклучок добиен од базалната мембрана

4. Варете го приклучокот за гел добиен од базалната мембрана

5. Определување на составот на клетката во клеточната суспензија со анализа на едноклеточен Western blot (scWB)

6. Извлечете го чипот scWB

Резултати од репрезентацијата

За пристап до хемолокантната реакција на моноцитите во крвта, инјектиравме раствор добиен со дерасте мембрана, преполн со возила и MCP-1, во левата и десната страна на секој глушец. Гел приклучоци добиени од подрумска мембрана беа отстранети, одделени и клетките регрутирани во секој приклучок 1, 3 и 5 дена по инјекциите (Слика 1А) Со одземање на бројот на ќелии во приклучокот полн со возило (отворени шипки) од бројот на ќелии во приклучокот наполнет со MCP-1 (затворени шипки), го добивме бројот на ќелии кои беа специјално регрутирани како одговор на MCP-1 (број на ќелија, слика 1B) Забележавме забрзано специфично регрутирање и акумулација на клетки MCP-1 во период од 5 дена, со зголемување на стапките од 31 000 клетки на ден (ден 1) на 78 000 клетки на ден (ден 3) и 136 000 клетки на ден на 5-ти ден (Слика 1Б).

Статистичката евалуација на податоците прикажани овде е извршена со софтвер за анализа (на пр. СигмаПлот 14). АНОВА проследено со Фишер ЛСД-тест беше искористена за споредување на средствата помеѓу експерименталните групи. Сите податоци се претставени како просечна СД од најмалку 3 независни експерименти. Резултатите беа на ниво P Слика 1 : Квантификација на клетките што регрутирани во поткожни дермамбрани добиени гел приклучоци во подрумот волја. (А.) Апсолутни броеви на ќелии за приклучоци за гел во подрумската мембрана наполнети со возило (отворени шипки) и MCP-1 (затворени шипки). (Б.) Бројот на ќелии регрутирани од MCP-1 во гел приклучоци добиени од подрумска мембрана се пресметува како разлика во бројот на клетките помеѓу приклучоците натоварени со MCP-1 и возилата. Резултатите се прикажани како просечна sD (n = 4). Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

активност

Слика 2 : Анализа на популации на клетки регрутирани во гел приклучоци добиени од базална мембрана со едноклеточна анализа на Western blot беа. (А + Б.) Претставнички примери за анализа на scWB на натоварено возило (Контрола) и приклучок за lende MCP-1 (MCP-1) прикажани се изолирани од глувчето три дена по инјекцијата. Чипови обележани со антитела кон CD45, CD11b и F4/80 проследени со флуоресцентни секундарни антитела како што е опишано во протоколот. Интензитетот на флуоресценција на обележаната лента за секоја одделна клетка е прикажан како област на врвот. (C + D) Клеточните популации беа идентификувани како моноцити (CD11b + F4/80 -,), макрофаги (CD11b + F4/80 + плус CD11b - F4/80 +,) или како немоноцитни леукоцити (CD45 +,). Останатите ќелии беа именувани како „други“ (). Резултатите се прикажани како просечна sD (n = 3). Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

квантификација

Слика 3 : Содржина на моноцити и макрофаги во гел приклучоци од Дерампен. Квантитативна анализа на регрутираните нивоа на моноцити и макрофаги во приклучоци натоварени со возило и наполнети со MCP-1, кои беа отстранети на 1, 3 и 5 дена по инјекцијата. Вредностите се изразени како процент од вкупната популација на клетки (А + Б.) и во апсолутен број на ќелии по приклучок (В. +Д.) се прикажува. Резултатите се прикажани како просечна sD (n = 3). Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

Дискусија

Постојат голем број ограничувања на анализата што треба да се земат предвид. Прво, манипулацијата со глувчето, вклучувајќи анестезија, вбризгување на решенија добиени од базална мембрана и хируршко плакнење, бара пракса за да се генерираат индивидуални приклучоци и податоци што можат да се репродуцираат. Второ, додека повеќето од клетките кои се регрутираат во наполнетите приклучоци MCP-1 се моноцити и макрофаги, значителен број не се. Ова може да влијае на толкувањето на други аналитички анализи базирани на не единечни клетки, направени врз оваа популација на клетки. Бидејќи условите за клеточна лиза за scWB се благи, миграциските растојанија на протеините можат да отстапат од стандардната ЗБ и да не корелираат со големината на протеините. Затоа, и клеточната лиза и времето на траење мора да бидат потврдени за секој нов протеин што треба да се тестира и за секое примарно антитело.