Лептинот влијае врз прометот на цревните епителни клетки во корелација со изразот на рецептори на лептин

апстрактен
Главна
МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДИ
Ивотни.
Експериментален дизајн.
Хируршка процедура.
Параметри на прилагодување на дебелото црево.
Хистолошки преглед.
Микроодисекција со ласерско снимање и подготовка на РНК.
RT-PCR.
PCR во реално време.
Пролиферација на криптни клетки и апоптоза на ентероцити.
Изразување на гените Bax и Bcl-2.
Статистичка анализа.
РЕЗУЛТАТИ
Параметри на прилагодување на дебелото црево.
Пролиферација на ентероцити и апоптоза во јејунумот.
Долга форма на изразување на LEPr и промет на ентероцити во крилести крипти.
Долга форма на изразување на LEPr и ентероцитна апоптоза кај илеални ресички.
Изразување на гени поврзани со апоптоза.
ДИСКУСИЈА
речник

апстрактен

Опширни студии во различни експериментални модели на синдром на кратко црево (СБС) покажаа дека ентероцитната апоптоза игра клучна улога во адаптацијата на цревата по ресекцијата (1, 2). И покрај потребата од цревна хиперплазија, митотичните стимули не можат да ја потиснат програмираната клеточна смрт (3). Многу истражувачи ја опишаа зголемената апоптоза на ентероцитите како механизам што компензира за зголемена пролиферација на ентероцити за да се постигне нова хомеостатска стапка при прилагодување на дебелото црево (4). Зголемената апоптоза промовира отстранување на генетски аберантни матични клетки и спречува развој на тумор (3, 4).

Адаптацијата на цревата по цревна ресекција доведува до зголемена пролиферација на цревните епителни клетки, како и до зголемена програмирана клеточна смрт, што укажува на забрзан обрт на клетките. Резултатот од овие дејства помага да се преобликуваат структурите на крилјата на криптата во повеќе издолжени и функционално поактивни единици. Регулирањето на рамнотежата помеѓу производството на клетки и загубата на клетките преку апоптоза по ресекција на дебелото црево е сложено и точните фактори кои го водат овој процес на адаптација остануваат нејасни (11, 12). Особено, не е јасно каде многу од овие трофични фактори работат по оската крипт-вилус. Неодамнешните откритија сугерираат дека различните фактори на раст, како што се факторот за раст на кератиноцити (13) и факторот за раст на епидермисот (14), се изразуваат поинаку долж оската крипто-вилус. Ова сугерира дека различни трофички фактори можат да дејствуваат на различни места долж оваа оска. Неодамна покажавме дека TGF-алфа (TGF-α) симулира промет на ентероцити според изразувањето на рецепторот на факторот за раст на епидермалниот долж оската на крилјата (15).

Дебелиот ген протеински производ лептин (ЛЕП) се излачува од адипоцитите и делува првенствено на хипоталамусот, кој ги регулира потрошувачката на енергија, внесувањето храна и телесната тежина (16). Иако цревата не е класично целно ткиво за ЛЕП, обемни студии во различни експериментални модели покажаа дека ЛЕП одредува важни физиолошки ефекти врз цревниот раст, созревањето и диференцијацијата на клетките (17, 18). Во претходната работа, покажавме дека ЛЕП ја стимулира адаптацијата на цревата по масивна ресекција на тенкото црево кај стаорец (19). Сепак, малку се знае за механизмите што стојат зад овој позитивен ефект.

Целта на оваа студија беше да се истражат ефектите на ЛЕП врз прометот на ентероцитите (пролиферација и апоптоза) во врска со експресијата на ЛЕП рецепторите (ЛЕПр) долж оската на крилјата по масивната ресекција на тенкото црево кај стаорци.

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДИ

Ивотни.

Институционалниот комитет за грижа и употреба на животните на медицинското училиште Рапапорт (Техонион, Хаифа, Израел) ги одобри објектите и протоколите за животните. Машки возрасни стаорци Sprague-Dawley со тежина од 240 до 260 g беа сместени во индивидуални кафези од не'рѓосувачки челик на постојана температура и влажност и се одржуваше 12-часовен светло-темно циклус. Стаорците биле постени со слободен пристап до вода 12 часа пред експериментот. Општа анестезија е иницирана со кетамин (IP 90 mg/kg) и ксилазин (IP 15 mg/kg).

Експериментален дизајн.

40 стаорци беа случајно распоредени во една од трите групи: група А, лажни стаорци беа подложени на интестинална транссекција (измама, n = 14); Groupивотните од групата Б, СБС биле подложени на ресекција на дебелото црево (СБС, n = 13); и стаорци од група Ц, СБС-ЛЕП биле подложени на ресекција на дебелото црево (СБС-ЛЕП, n = 13) и биле третирани со ЛЕП во ip доза од 50 мг/кг од д 4 до д 14.

Хируршка процедура.

Стаорците биле подложени на една од двете хируршки зафати: пресекување на дебелото црево проследено со реанастомоза или 75% ресекција на цревата. Користејќи стерилни техники, стомакот се отвори со засек од средна линија. Кај лажните стаорци, средното тенкото црево беше пресечено и повторно составено без ресекција на дебелото црево. Кај животните од СБС беше извршена 75% ресекција на средно тенкото црево слична на онаа што претходно беше опишана. Ова се состоеше од ресекција на цревата помеѓу 5 см оддалеченост од лигаментот на Фон Трејц и 10 см проксимално од илеоцекалниот вентил. Континуитетот на дебелото црево беше обновен со анастомоза од крај до крај со употреба на апсорбирачки конци од 6-0 (Викрил, корпорација Етикон, САД). Во сите операции, абдоминалната празнина беше затворена во два слоја со конци од 3/0 Викрил (корпорација Етикон, САД). На постоперативните стаорци им беше дозволено ad libitum вода и течна диета. Стаорците биле жртвувани на 15-ти ден со инјекција на пентобарбитал (75 мг/кг).

Параметри на прилагодување на дебелото црево.

Тенкото црево беше брзо отстрането, исплакнето со ладен изотоничен солен раствор и поделено на два сегмента: јејунумот проксимално на анастомозата и терминалниот илеум. Дебелото црево беше поделено на антимесетеричната граница, измиено со ладен солен раствор, исушено и секој сегмент беше измерен. Слузницата беше изгребана од основното ткиво со шпатула (Сигма хемиски копродукции, Израел). Примероците од мукозата беа хомогенизирани со реагенс ТРИзол. ДНК и протеини беа извлечени со методот Чомчински (20) и изразени како микрограми на сантиметар црево на 100 грама телесна тежина.

Хистолошки преглед.

Хистолошките делови беа направени од проксималниот јејунум, дисталниот илеум и слични места кај контролните животни. Сегментите на тенкото црево беа фиксирани во 10% формалин за 24 часа и преработени во стандардни блокови на парафин. Пет микрони ткивни делови беа обоени со хематоксилин и еозин. Висината на вили и длабочината на криптата беа измерени со помош на софтвер за анализа на слика Image Pro Plus 4 (Media Cybernetics, Балтимор, М.Д.). Измерени се десет ресички и крипти во секој дел и просечното отчитување е снимено во микрометри.

Микроодисекција со ласерско снимање и подготовка на РНК.

Деловите со дебелина од 15 микрометри беа монтирани на специјални слајдови опфатени со мембрана без RNase и УВ-третирани (PALM Technologies, Bernried, Германија) и веднаш фиксирани во ладен 70% етанол за 2 минути. По инкубација 60 секунди во 1% крезил-виолетова ацетат, деловите беа дехидрирани во серија етанол (70 и 100% на мраз) и беа оставени на кратко да се исушат на воздух. Слајдовите се чуваа на -80 ° C до микродесекција. Деловите беа ласерски исечени во рок од 3 дена. Слајдовите беа набудувани со употреба на превртен микроскоп за фаќање ласер Zeiss Axiovert 200 M и се визуелизираа на монитор со помош на софтверот PALM Robo. Врвовите на ресичките, страничните ресички и криптите беа разделени со помош на ласер. РНК е извлечена со помош на RNeasy Microkit (Qiagen) и протоколот за микродесекција. Сите примероци беа чувани на -80 ° C за долгорочно чување.

RT-PCR.

Квалитетот на РНК беше оценет со системот за автоматизирана електрофореза Експерион (BioRad). Пет микрограми РНК беа превртени во cDNA на 37 ° C со употреба на 200 μM деоксинуклеотиди (Сигма хемиски копродукции, Сент Луис, МО), 5 μM случајни хексамери (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 20 U RNAguard (Amersham Pharmacia Biotech) препишана) и 200 U/μl Вирус на леукемија на глувчето Молони со реверзна транскриптаза (US Biochemicals, Кливленд, ОХ). Поставките на топлинскиот циклус се оптимизирани за да се осигура дека производите се во фаза на линеарно производство.

PCR во реално време.

Изразувањето на долгата форма на нивоата на LEPr беше одредено со квантитативно PCR во реално време на примероците од cDNA со помош на комплет за анализа на побарувачката TaqMan (ABsolute Blue QPCR ROX Mix (ROX боја) од ABgene, Epsom, Велика Британија) ABI-PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Единствени егзонски прајмери (од PrimerDesing Ltd, Велика Британија) се простираат на 3'UTR-1064 bp (сенсентно буквар, GCAGGGCTGTATGTCATTGTA; антисенс буквар, GAACATGGTCCCAAAACAACTT) се произведени за да се произведе ампликон со 109 bp. 18S (5'AGGAATTGACGGAAGGGCAC, 3'GTGCAGCCCCGGACATCTAAG) се користеше за пристап до истото оптоварување на cDNA за секој оддел. Букварите се специфични за долгата форма на LEPr и не се во истиот егзон; Инаку, засилувањето на контаминирачката ДНК не може да се разликува од засилувањето на cDNA.

Пролиферација на криптни клетки и апоптоза на ентероцити.

На стаорците им беше инјектиран стандарден реагенс за етикетирање на 5-бромодеоксиуридин (5-BrdU) (Zymed Lab, Inc, CA) во доза од 1 ml на 100 g телесна тежина 2 часа пред да се жртвува. Делови од ткиво (5 μm) се деаксираа со ксилен, се рехидрираа со оценет алкохол и се обојуваа со биотинилиран анти-BrdU систем на моноклонални антитела со помош на комплетот за боење BrdU (Zymed Lab, Inc, CA). Индексот на пролиферација беше утврден како однос на криптовите клетки кои боеја позитивно за BrdU на 10 крипти.

Дополнителни 5? Деловите беа дебели m за да се утврди степенот на ентероцитна апоптоза. Имунохистохемија за каспаза-3 (дигестирано концентрирано поликлонско антитело во каспаза-3; разредување 1: 100; Biocare Medical, Walnut Creek, CA) беше спроведена за да се насочат кон апоптотичните клетки со употреба на метод на стрептовидин-биотин-пероксидаза според протоколите на Идентификувајте го производителот. Изразот на апоптозата на епителните клетки се изразува како вкупен број на апоптотични клетки по оваа оска на 10 ресички и 100 крипти. Во некои случаи, беше извршена подетална анализа на локацијата на апоптозата со употреба на претходно утврдени техники (21). За таа цел, апоптозата по должината на ресичките се разликуваше од долната третина на ресичките (странични ресички) и горната третина од ресички (врвови на ресички). Апоптозата е евидентирана како број на апоптотични клетки на 10 ресички. Квалификуван патолог, слеп за изворот на цревното ткиво, ги направи сите мерења.

Изразување на гените Bax и Bcl-2.

Вкупната РНК беше изолирана од замрзнати примероци на мукоза (проксимален јејунум и дистален илеум) со употреба на реагенс ТРИзол (GIBCO BRL, САД) како што е опишано од Чомчински (20). Дел од вкупната РНК (2 µg во вкупен волумен од 25 μλ) беше обратен со помош на комплет за синтеза на cDNA на првата низа од вирус на молони леукемија (MMLV) (Gene Choice, Inc. Frederick, MD) препишани. По PCR, засилениот производ (5 μl) се истрча на 2% гел од агароза, обоен со етидиум бромид и беше фотографиран. Нивото на експресија на генот Bax и Bcl-2 беше изразено како однос на сивата густина на целниот ген и сивата густина на 18S во дензитометријата. Секвенците за специфичните гени беа следниве: повеќето mRNA се изразени, букварите 18S rRNA се разредуваат 1:10 со цел да се донесат RT-PCR производите во истиот експоненцијален опсег на засилување.

Статистичка анализа.

Податоците се изразени како средна ± СЕМ. За статистичка анализа со p-вредност беше користен еднонасочен ANOVA тест проследен со пост хок тест Bonferroni

Однос помеѓу експресијата на mRNA на рецепторот на лептин (B) и пролиферацијата на ентероцитите (A) и апоптозата (C) во криптите по масивната ресекција на тенкото црево и третманот со лептин. Вредностите се средства ± СЕМ. Зголемување 1: 100. * стр

Ефект на ресекција на дебелото црево и третман со лептин врз ентероцитната апоптоза (Б) во корелација со експресијата на рецепторот на лептин (А) во врвовите на ресичките и во страничните ресички. Вредностите се средства ± СЕМ. Зголемување 1: 100. * стр

Ефект на ресекција на дебелото црево и третман со лептин врз експресијата на Bax и Bcl-2 во примероци од мукоза на илеум. Вредностите се средства ± СЕМ. * стр. Морфолошките промени вклучуваат издолжување на ресичките и продлабочување на криптите, зголемена пролиферација на ентероцити и зголемена миграција на ентероцити по должината на ресичките. Функционалната адаптација доведува до зголемено внесување на хранливи материи од изолирани ентероцити (21-23).

Главната мана на студијата е што се анализираат само нивоата на mRNA на долгата форма на LEPr. Потребно е понатамошно експериментирање за да се оцени изразот на другите форми на LEPr за кои се знае дека постојат во разни ткива на стаорци.

Сумирајќи, третманот со ЛЕП го стимулира растот на цревата кај моделите на СБС кај стаорци. Зголемената експресија на LEPr mRNA по должината на оската на крилјата може да укаже на релевантна улога на LEP во модулацијата на ентероцитната апоптоза во гастроинтестиналната мукоза. Ефектот на ЛЕП врз прометот на ентероцитите силно корелира со долгата форма на изразување на ЛЕПр долж оската на криптата.