Мерења на реакции на физиолошки стрес во Ц.

Резиме

Тука ги карактеризираме клеточните протеотоксични реакции на стрес кај нематодата C. elegans со мерење на активирање на флуоресцентни репортери на транскрипција и набудување на чувствителноста на физиолошкиот стрес.

реакции

Апстракт

Вовед

Големо знаење за регулирање и активност на одговорите на клеточниот стрес му се припишува на нематодата Caenorhabditis elegans, повеќеклеточен модел на организмот во генетските истражувања. Нематодите овозможуваат да се проучи не само активирањето на стресните реакции на клеточно ниво, туку и на нивото на организмот; Нематодите се користат за проучување на ефектите од генетски нарушувања или изложеност на лекови и загадувачи врз нивниот раст и преживување. Нивното брзо време на генерирање, изогеност, транспарентност, способност за генетско влечење и лесна употреба при експериментирање ги прават идеални за такви студии. Покрај тоа, релативно брзата физиолошка реакција на стресот (помеѓу часови и неколку дена) и еволутивното зачувување на клеточните патишта ги прават нематодите одлична алатка во студијата на отпорност на стрес.

Покрај анализата на репортерот, чувствителноста или отпорноста на животните на стрес може да се измерат и со физиолошки стрес-тестови. Ова се постигнува со изложување на животни во стресни средини кои активираат одредени патеки на клеточен стрес. Различни методи се нудат тука за мерење на чувствителноста на цели животни на одредени видови на стрес.

ЕР стресот се применува на C. elegans со употреба на хемиски агенс туникамицин, кој ја блокира N-поврзаната гликозилација и предизвикува акумулација на погрешно преклопени протеини во ER 10. Кај C. elegans, растот доведува до значителни нарушувања во функцијата на ER и значително намален животен век при изложеност на туникамицин 11. Со мерење на преживувањето на животните на плочи што содржат туникамицин, чувствителноста на стрес на ER кај животните може да се измери. На пример, животните со ектопична индукција на УПР-ЕР и со тоа зголемена отпорност на стрес што лошо се преклопува во ЕР имаат зголемен преживување по изложеноста на туникамицин во споредба со дивите животни 12. ТОЈ

Оксидативниот и митохондријалниот стрес се применува на C. elegans со изложување на животните на хемискиот агенс паракват. Паракват е најчесто употребуван хербицид кој предизвикува формирање на супероксид специјално во митохондриите 13. Поради специфичната локализација на реактивните кислородни видови добиени од митохондриите (РОС), паракуат-анализите често се користат како „митохондријален“ стрес-тест. Сепак, супероксидот брзо се претвора во водород пероксид од митохондријалниот супероксид дисмутази (СОД) 14. Водород пероксид потоа може да дифундира надвор од митохондриите и да предизвика оксидативен стрес во другите делови на клетката. Затоа, ги опишуваме анализите за преживување на паракват како мерка за чувствителност и на митохондријалниот и на оксидативниот стрес (други анализи на оксидативен стрес, видете 15).

Тестовите за топлинска компатибилност се вршат во C. elegans со поставување животни во покачени температури. Температурите на околината кај нематодите се 15-20 ° C, а топлинскиот стрес е индуциран на температури над 25 ° C 16, 17. Тестовите за топлинска компатибилност обично се изведуваат на температура од 30-37 ° C, бидејќи животните имаат големи клеточни дефекти на оваа температура и тестовите за преживување се завршуваат во рок од 24 часа 16, 18. Тука се разгледуваат два алтернативни методи при вршење на тестови за термотолеранција: раст на 34 ° C и раст на 37 ° C. Заедно, протоколите презентирани овде може да се користат за изведување екрани од големи размери кога се комбинираат со стандарден генски нокдаун со мешање на РНК или библиотеки со хемиски лекови.

Протоколот може да се расчлене на 4 општи процедури - раст на C. elegans и подготовка за сликање (Дел 1 и 2), слика на репортери за транскрипција со помош на флуоресцентна микроскопија (делови 3-5), квантитативни мерења на известувачи со користење на голем проток на честички - Цитометар (Дел 6) и физиолошки игли за мерење на чувствителност на стрес кај C. elegans (Дел 7).

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

1. Стандардни услови на растење на температурите & OP50 наспроти HT115

2. Инсталирање/синхронизација на црви со белење

5. Снимање со стерео микроскоп или широк поле/сложен микроскоп со мало зголемување

6. Квантитативни мерења од репортери со голем цитометар на проток на честички

ЗАБЕЛЕШКА: Растот и подготовката на црви за континуирана анализа на цитометар со големи честички може да ги следи истите парадигми како и делот 1-5 за подготовка на црви за слики со флуоресценција, освен што се потребни поголем број животни . Користете> 500 животни по состојба бидејќи некои животни ќе бидат изгубени при манипулација, не сите животни ги исполнуваат критериумите за филтрирање за време на квантитацијата, а некои животни нема да бидат правилно прочитани од цитометарот за проток. Измијте ги животните за сортирање плочи во 5-10 ml раствор M9 во 15 ml конусни цевки за последователно сортирање на цитометарот на проток.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Користење на репортери за транскрипција за мерење на активирање на одговорите на стрес
Ова е местото каде што се користат репортери за флуоресцентна транскрипција, кои служат како робусни алатки за мерење на активирање на повеќето реакции на стрес кај C. elegans. Изразот на GFP е воден, под поддршка на канонски цели, од страна на мастер регулаторите за транскрипција вклучени во одговарање на специфични стресови на темата. За сеопфатен список на најчесто користени репортери за транскрипција, видете Табела 3.

Физиолошки анализи за мерење на подложност на стрес кај C. elegans
C. elegans се одличен модел на организмот за мерење на чувствителноста на стресот поради ниската цена на одржување и експериментите и леснотијата на уредување на геномот или генетскиот удар со RNAi, што обезбедува можност за спроведување на големи експерименти во целиот организам. За да се анализира толеранцијата на стрес на ER стресот, ние ги изложивме C. elegans на хемискиот туникамицин, што предизвикува акумулација на оштетени протеини во ER со блокирање на N-поврзаната гликозилација 10. Developmentивотните се изложени на туникамицин по развојот, бидејќи лекот предизвикува дефекти во развојот. Кога се изложени на туникамицин, возрасните црви покажуваат значително намалување на животниот век. Покрај тоа, нокдаунот на генот xbp-1, кој кодира еден од примарните фактори на транскрипција вклучен во индукцијата на UPR ER, доведува до значително зголемување на чувствителноста на туникамицин (Слика 5А.) 12 ЕР Така, ова служи како робустен тест за мерење на чувствителноста на стрес во ER кај возрасни црви.

За да ги измериме оксидативниот стрес и митохондријалниот стрес, ние ги изложуваме животните на хемиското соединение паракват. Паракват предизвикува митохондријален стрес преку синтетизирање на РОС во рамките на митохондријалната матрица, кој потоа може да се претвори во водород пероксид и да се дифундира надвор од митохондриите за да предизвика оксидативно оштетување на целоклеточните 13. Слично на анализите за стрес во ЕР, ние ги изложуваме животните на паракват во зрелоста. Сепак, правиме анализи со течни параквати за да ги намалиме трошоците и рачната работа, а анализите базирани на агар би биле тешки за повеќето лаборатории. Тука покажуваме дека животните изложени на паракват во течна течност имаат просечно преживување од околу 5 часа (Слика 5)Б.) Покрај тоа, нокдаунот на рецепторот за инсулин daf-2 доведува до зголемена отпорност на паракват, бидејќи активирањето на DAF-16/FOXO доведува до зголемена експресија на видовите вклучени во клиренсот на ROS, на пр. Б. Сод-3 42, 43. Тестовите за преживување на Паракват се кратки, траат до 14 часа, а со тоа служат како ефикасен метод за да се доведат во прашање митохондријалните и оксидативните стресни одговори.

Табела 3: Новинар за транскрипција за проценка на активирањето на одговорите на клеточниот стрес. Видовите наведени овде се достапни преку CGC или преку специфични лабораториски истражувања за употреба во квалитативните и квантитативните процедури за сликање опишани во овој ракопис. Овие соеви се добиени од позадината на Бристол N2. Дадени се и препорачани методи за примена на стрес за активирање на известувачите. Сите репортери, со исклучок на sod-3p: GFP 45 и T24B8.5p: GFP 46, се опишани во текстот.

Трансгеничен Препорачана апликација (и) на напнатост Време на експозиција со стерео микроскоп Leica M2250FA Време на изложеност со микроскоп Revolve ECHO PMT вредностите со органски сортирач на Union Biometrica COPAS
hsp-4p: GFP 25 g/ml туникамицин (приближно 4 часа со ноќно опоравување) 200 ms 275 ms 450 година
hsp-6p: GFP 3 М антимицин А (околу 16 часа); 100 мил 50 ms 350 година
RNAi против ЕТЦ или митохондријален рибозом (од отворот)
hsp-60p: GFP 3 М антимицин А (околу 16 часа); 200 ms 100 ms 450 година
RNAi против ЕТЦ или митохондријален рибозом (од отворот)
hsp-16.2p: GFP 34 ° C 2 часа 400 ms 200 ms 500
hsp-70p: GFP 34 ° C 2 часа 400 ms 300 ms 500
gst-4p: GFP 50 мм паракват (приближно 2 часа); 100 ms 50 ms 350 година
2 мм терц-бутил хидропероксид (приближно 4 часа со ноќно опоравување)
бусен-3p: GFP RNAi против Даф-2 (рецептор на инсулин) 300 ms 300 ms 475 година
T24B8.5p: GFP Изложеност на патоген (на пример, P. aeruginosa) 100 ms 50 ms 350 година

Табела 4: Препорачани поставки за микроскопија на флуоресценција и квантификација со биосортирање на големи честички. Оваа табела е наменета како водич за препорачаните времиња на изложеност на флуоресцентна микроскопија или вредности на PMT за биосортирање на големи честички. Овие служат како добра почетна точка, но времето на експозиција и вредноста на PMT треба да се прилагодат за секој експеримент за да се осигура дека нема да се појави сатурација и дека вредностите на флуоресценцијата се над границата на откривање на сигналот во позадина. Ако примерокот со најсјајниот сигнал е познат по експеримент (на пр. Позитивни контроли за индукција на напон), овие примероци може да се користат за да се одреди највисокото време на изложеност или PMT, што може да се користи без сигнал за заситеност. Доколку не се познати најсјајните примероци, контролорот може да се користи и може да се користи време на експозиција или PMT во средината на динамичкиот опсег на вашиот систем.

Табела 6: Препорачани гени цели и парови на буквари за мерење на транскрипциската урегулација на гените од одговор на стрес.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Друго ограничување на опишаните методи е дека сликата и квантификацијата од биосортир има ограничена пропусна моќ. Додека квантитацијата на биосортирачите во плочки со 96 бунари може да се направи за поголема пропусност, сепак е ограничена од потребата за пренесување црви во раствор додека сликата е ограничена од способноста на испитувачот да подготви црви и да изврши микроскопија, е ограничен. Затоа, големите екрани најверојатно ќе вклучуваат само визуелен скрининг на флуоресцентниот сигнал на репортерот, со тоа што само хитовите ќе бидат мапирани и квантифицирани.

Сите опишани методи може да се користат независно или во комбинација за сеопфатна анализа на гените или лековите од интерес и нивните ефекти врз реакцијата на стресот. Екраните со голем формат можат да се извршуваат со анализа на репортер за транскрипција со висока пропусна моќ, а секундарните екрани може да се извршат со квантитативна анализа на овие известувачи. Веднаш штом ќе се идентификуваат списоците на гени/лекови со кандидати што може да се контролираат повторно, може да се спроведат физиолошки тестови за да се идентификуваат кандидатите кои имаат директно влијание врз целокупната физиологија на животните. Другите методи предложени погоре, исто така, можат да се користат за валидација или понатамошна истрага.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.