Мерење на базална и стимулирана од Форсколин липолиза во протокол на ингвинални масни масти

Резиме

Овој протокол го опишува методот за одредување на базална и стимулирана липолиза на форсколин во влошки на ингвинални маснотии добиени од нормална диета на Chow (NCD) или диета со висока содржина на маснотии (HFD) wild глувци од див тип кои се хранат со капсаицин. Ослободувањето на глицерин од влошки на ингвинална маст е измерено како индекс за липолиза.

мерење

Апстракт

Липолизата е процес во кој липидите складирани како триглицериди во масните ткива се хидролизираат во глицерол и масни киселини. Оваа статија го опишува методот на мерење на базолна и форсколинска (FSK) стимулирана липолиза во ингвиналните масни влошки изолирани од глувци од див тип на диета со нормална храна (NCD), диета со многу маснотии (HFD) или диета со многу маснотии со 0 01% дес капсаицин (CAP; агонист на примарен рецептор на ванилоид подфамилија 1 (TRPV1)) се хранеше 32 недели. Методот опишан овде за изведување на ек виво липолиза се користи од Швајгер и сор. 1 Ви претставуваме детален протокол за мерење на нивото на глицерол со UV-видлива (UV/VIS) спектрофотометрија. Методот опишан овде може да се користи за успешно изолирање на влошки на ингвиналните маснотии за мерења на липолизата за да се добијат конзистентни резултати. Протоколот опишан за влошки на ингвинални маснотии може лесно да се продолжи за да се измери липолизата во другите ткива.

Вовед

Масните ткива складираат енергија како маснотии 2 и оксидација на масни киселини е потребна за термогенеза 3, 4. Масните киселини кои се консумираат преку диети се пакувани во хиломикрони заедно со апопротеини и се ослободуваат во различни ткива во телото преку крвотокот. Иако повеќето клетки во телото складираат резерва на енергија, масното ткиво ја складира вишокот енергија како маснотии 5, 6. Липолизата во масното ткиво е регулирана со сложени процеси и молекуларните детали за липолизата сè уште остануваат нејасни 7 .

Липолизата е процес во кој триглицеридите (TGL) складирани во масното ткиво се хидролизираат за да произведат глицерол и масни киселини (ФА) од страна на ензимот масна триглицерид липаза (ATGL) 8. Промените во базалната и стимулирана липолиза е карактеристична карактеристика на дебелината. Асалната липолиза е регулирана со активирање на ATGL 9, што го претвора TGL во диацилглицерол (DAG), кој потоа се хидролизира во моноацилглицерол (MAG). Активирањето на хормонска чувствителна липаза (HSL) преку аденилил циклаза ја активира цикличната стимулација на аденозин монофосфат (cAMP) зависна од протеинска киназа А (PKA) и предизвикува липолиза. Затоа, мерењето на липолизацијата, базално и стимулирано, е важно за да се анализира активноста на протеините вклучени во овој процес. Дешифрирањето на молекуларната регулација на липолизата исто така може да биде корисно во развојот на нови терапевтски стратегии против дебелината 10. Бидејќи молекулите што ја стимулираат липолизата и оксидацијата на масни киселини се потенцијални кандидати за намалување на мастите складирани во депоа, важно е да се користи робустен тест за репродуктивност.

Досега објавените податоци сугерираат дека активирање на TRPV1 протеинот, изразен во бело масно ткиво, со CAP-базиран и FSK (активатор на аденилил циклаза) - стимулирана липолиза во ингвиналните влошки на маснотии 11. Досегашните истражувања исто така сугерираат дека долгорочното активирање на TRPV1 од CAP го активира PKA12. Бидејќи активирањето на PKA ја стимулира липолизата 13, 14, и базалната и PKA-зависната стимулирана липолиза во ингвиналните масни влошки, кои по 32 недели хранење со соодветните диети на NCD или HFD (± CAP) -Fed- Глувците биле изолирани за да се потврди улогата на активирање на TRPV1 во липолизата

Оваа статија опишува ефикасен метод за одредување на базална и стимулирана липолиза. Иако се достапни други методи кои обезбедуваат радиоактивни изотопи на глицерин и досадна течна хроматографија со високи перформанси или гасна хроматографија/масовна спектрометрија за мерењата 15, 16, овој метод обезбедува едноставна, едноставна и ефтина техника за одредување на липолизата во масното ткиво.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Сите протоколи ги следат упатствата за благосостојба на животните на Универзитетот во Вајоминг.

1. Сточарство и хранење животни

ЗАБЕЛЕШКА: Возрасни машки глувци од див тип (C57BL/6) (возраст од 12 до 24 недели) биле одгледувани во објектот за истражување на животни според протоколите одобрени од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни (IACUC).

  1. Од 6-та недела од животот, домашните глувци во четиричлени групи во одделни кафези и по случаен избор ги распоредуваат во групи на хранење со NCD или HFD (± 0,01% CAP) до 38-та недела од животот.
    ЗАБЕЛЕШКА: CAP е агонист на протеинот на каналот TRPV1 изразен во масните ткива 11, 17. Измешајте CAP со HFD во мешалка во аспираторот и пренесете ја измешаната смеса во плех со мали разделувачи 1 во 2. Држете го послужавникот во замрзнувач од -20 ° C. Извадете го плехот со диета HFD + CAP од замрзнувачот по 24 часа и чувајте го во контејнер на замрзнувач од -20 ° C до употреба.
  2. Куќи глувци во климатизирана средина (22,8 ± 2,0 ° C, влажност од 45-50%) со 12/12 светло/темно циклус со пристап до назначена диета и вода без ограничување .
  3. На крајот од 38 недели, лачете масно масно ткиво и користете за експерименти со липолиза (делови 2-7).

2. Подгответе глувци за експериментите

  1. Анестетизирајте глувци со инјектирање мешавина на кетамин и ксилазин (10 mg/kg и 80 mg/kg телесна тежина, соодветно). Инјекција на 0,01 ml од смесата/10 g телесна тежина на глувчето.
  2. Потврдете ја длабоката анестезија со цврст нотка на прстите. Ако има рефлекс на педалата, повторно тестирајте го глувчето по најмалку 30 секунди.
  3. Користете ветеринарни лекови за да спречите сувост на очите за време на анестезија. Не оставајте глувци без надзор во текот на која било од постапките.
  4. Еутанизирајте глувци со инјектирање висока доза на мешана инјекција со кетамин и ксилазин (10 mg/kg и 80 mg/kg телесна тежина, соодветно) E (0,01 ml/10 g телесна тежина) проследено со дислокација на грлото на матката.
    ЗАБЕЛЕШКА: Овој метод на еутаназија е одобрен од IACUC на Универзитетот во Вајоминг.

3. Изолација на ингвинални масни влошки

15 мин).

  • Изолирајте ги масните влошки од десната страна на глувчето, како што е опишано во чекорите 3.2-3.6.

    • 4. Ослободување на базалниот глицерол од ингвиналните масни влошки

    5. FSK-стимулирана липолиза

    6. Подготовка на слободен реагенс за глицерол

    1. Конструирајте го глицеринскиот реагенс 19 во 40 ml дејонизирана вода во вијала од стаклена килибар, ставете затворач на шишенцето и измешајте 10 пати. Не мешајте со тресење.
    2. Чувајте го шишенцето на 4 ° C во фрижидер далеку од светлина со целосно покривање на вијалата со алуминиумска фолија.
    3. Продолжете да го подготвувате стандардот за глицерин (дел 7).

    7. Подготовка на стандардот за глицерин и одредување на содржината на глицерин

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    Липолиза
    (Нмол глицерин/mg протеин/час)         		НЦД
    (N = 6)         		HFD
    (N = 6)         		HFD + CAP
    (N = 6)
    Базален 16,22 ± 1,28 17,16 ± 1,48 52,07 ± 2,66
    ФСК стимулира
    (Со триацин Ц)    		 54,88 ± 3,27 41,23 ± 4,43 72,04 ± 4,16

    Табела 1: Ефект на CAP врз базалната и FSK-стимулирана липолиза во ингвиналните масни влошки. Средно базално и FSK-стимулирано ослободување на глицерол ± СЕМ, измерено во ингвинално масно ткиво, добиено од глувци од див тип кои се хранат со NCD-, HFD- или HFD + CAP.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Процесот на деградација на TGL во глицерол и масни киселини се катализира од ATGL 9 за време на базалната липолиза и се оркестрира со голем број протеини, вклучително и активирање на патеката зависна од аденилична циклаза/PKA при стимулирана липолиза 21, 22, 23. Со зајакнување на липолизата се зголемуваат масните киселини во плазмата за транспорт и потрошувачка на енергија 24. Масните киселини се апсорбираат од митохондриите како ацетил-CoA, кој се користи за енергија.

    Оваа статија го опишува методот на мерење на ослободување на глицерин од бело масно ткиво. Иако се достапни неколку методи со стабилни изотопи на глицерин, тие бараат или течна хроматографија со високи перформанси или гасна хроматографија/масена спектрометрија за мерења 15, 16. Мерењата на радио-трасерот на глицерин се поврзани и со неспецифичностите 31. Алтернативни методи вклучуваат одредување на нивоата на mRNA и протеини во липазите и регулаторните протеини вклучени во липолизата. Колориметриски методи се исто така достапни за датумите концентрација на масни киселини со долг ланец во оптек. Методот опишан овде е многу ефикасен во анализата на ослободувањето на глицерол од масните ткива, што може да се направи со читач на плочи способен за мерење на флуоресценција и апсорпција. Поедноставениот аналитички метод за ослободување на глицерол опишан во овој напис, исто така, обезбедува подобрена стабилност и прецизност 32 .

    Треба да се практикуваат стандардни оперативни процедури бидејќи овој метод вклучува хируршки техники за изолирање на масни наслаги. Овој протокол препорачува употреба на БСА без маснотии. Ова може да доведе до формирање на воздушни меури што ќе влијаат на мерењето на апсорпцијата. Затоа е важно да се осигура дека се постапува со примероците за да се избегнат воздушни меури. Треба да се внимава да не се тресат или превртуваат примероци за време на третманот со БСА, освен ако таков чекор не е препорачан во протоколот. Исто така, чекор на екстракција на маснотии од ингвинална маст е критичен бидејќи присуството на маснотии се меша со одредувањето на протеинот на H ингвиналното масно ткиво. Покрај тоа, при подготовка на стандарди за глицерин, важно е да се меша содржината со инверзија и да не се тресат вијалата.

    Постапката опишана овде може да се искористи за успешно изолирање на влошки на ингвиналните маснотии за повеќе анализи, вклучително и мерења на липолизата. Протоколот за липолиза опишан за влошки на ингвинални маснотии може лесно да се прошири за да се измери липолизата во другите ткива. Методите се оптимизирани за сите видови масни влошки и преадицити.

    Сумирајќи, овој напис го опишува методот за мерење на базалното и FSK-стимулирано ослободување на глицерол во ингвиналните масни киселини изолирани од глувци со храна од NCD или HFD (± CAP). Презентираните податоци сугерираат дека активирањето на TRPV1 со CAP ја зголеми базалната и FSK-стимулирана липолиза и спречи акумулација на липиди во масното ткиво. Овие податоци покажуваат клучна улога за TRPV1 протеинот во регулирањето на липолизата во белото масно ткиво

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.