Метод заснован на пловност за одредување на нивото на маснотии во протоколот за Дрософила (превод на германски)

Резиме

Тука презентираме метод за мерење на нивото на организмот во мастите во третиот ларвовечки ларв (L3) ларвовец на Drosophila melanogaster. Оваа постапка користи релативно мала густина на масното ткиво за да направи разлика помеѓу ларвите со изменето складирање на маснотии. Анализата заснована на пловност е важна алатка за брз, репродуктивен и економичен скрининг.

Вовед

Постапката се покажува како што следува, користејќи ја разликата во густината помеѓу масното и посно ткиво. Масното ткиво кај цицачите има густина од околу 0,9 g/ml 14, додека скелетните мускули имаат густина од 1,06 g/ml 15. Оваа разлика значи дека животните со поголеми залихи на маснотии имаат помала густина од животните со помали резерви на маснотии кои им овозможуваат да плови во раствор со подобра цврста густина. Овој имот овозможува исклучително брз преглед на голем број животни, додека е ефтин и неинвазивен. Анализата заснована на пловност беше искористена за да се потврдат фенотипите на промена на познати регулатори на нивото на маснотии, како и да се идентификуваат нови генетски и невролошки регулатори на дебелината.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

1. Соберете јајца од руно со генотипови од интерес

ЗАБЕЛЕШКА: Идеалните крстови се состојат од 150 девици муви и најмалку 75 мажи. Треба да има најмалку 200 муви на колекциите.

2. Трансфер на ларви во експериментална храна

  1. Подгответе експериментална храна.
    ЗАБЕЛЕШКА: Овој рецепт за храна се заснова на средниот рецепт на Блумингтон Акции 18. Важните промени, како што се проценуваат, вклучуваат зголемување на количината на квасец за да се оптимизира хранливата вредност на храната со темпирање на фазата на одење (помеѓу 112-120 часа по собирањето јајца на 25 ° C) Додека го најдовме овој рецепт идеален за здравјето и развојот на нашите експериментални ларви, рецептот за храна е прифатлив со оглед на калибрација со позитивни и негативни контроли, чии примери се наведени во чекор 3.10.
    1. Измерете 1600 ml дестилирана вода.
    2. Измешајте 134 g пченкарно брашно, 10,6 g агар Дрософила тип II и малку вода (

    500 ml) во чаша од 1 l. Мешајте 2 мин со моторизиран рачен миксер. Измешајте 70 гр жив сув квасец, 18,4 гр брашно од соја, 84,8 гр екстракт од слад и малку вода (

    3. Определете ги нивоата на маснотии во ларвите

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    илустрација 1 покажува пример за тоа како анализата заснована на пловидба може да открие и поголеми и пониски резерви на маснотии во генетски дизајнирани ларви. 1А покажува дека стимулацијата или замолчувањето на одредена подгрупа на неврони (E347) во мозокот на ларвата предизвикува пониски и повисоки резерви на маснотии. И во двата случаи се користеше иста генетска контрола во позадина. 1Б покажува пример за тоа како овој фенотип добиен со анализа на густината е потврден со неутрална екстракција на липиди и квантификација од GCMS.

    пловност
    илустрација 1. Нервната функција во одредени региони на ларвиот мозок е неопходна и доволна за на маснотии во телото - регулатива. Нервната активност во посочената линија E347-GAL4 беше замолчена со прекумерна експресија на Shi DN или активирана со прекумерна експресија на NB, како што е наведено во панелите, а ефектите врз масното ткиво беа оценети. (А) Процент на ларви пливаат во рамнотежа во раствори со различна густина Испитани се педесет ларви по биолошка репликација, n = 7-9 биолошки реплика по генотип (Б) Процент на телесни маснотии (тотално неутрални липиди, вклучително триацилглицериди и фосфолипиди поделени со телесна тежина), мерено со GCMS 17,20 (n = 8). Сините линии или шипки претставуваат животни пресечени со GAL4 (без УАС) со 1118 за ефекти на генетска позадина за контрола на. P-вредностите ги претставуваат резултатите од дво-опашките t-тестови. **** Р 16 се смени. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа бројка.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Дополнителна придобивка на оваа техника во однос на другите е зголемената чувствителност на мали промени во нивото на маснотии кај популацијата. Со водење на цел градиент на концентрација кај популација од 50 ларви, малите поместувања во вредностите на маснотиите во населението се идентификуваат со промена на средните концентрации, иако концентрацијата на ларвите започнува да лебди и е целосна, можеби не се разликува од контролите лебдеше. Оваа мала промена во популацијата не може секогаш да се идентификува со други методи за квантификација на маснотиите, бидејќи бара да се анализира голема група на ларви. Тестот за густина, од друга страна, испрашува индивидуи во населението и, следствено, може да ги открие овие мали промени или поместувања во вкупната дистрибуција на населението.

    Бидејќи оваа техника се потпира на густината на растворот за да се добијат сигурни резултати, исклучително е важно PBS и сахарозните раствори да се прават конзистентно. Откривме дека различните рецепти на PBS произведуваат разлики во густината на растворот и доведуваат до различни резултати. Consistentе го користиме рецептот наведен погоре за постојани резултати. Покрај тоа, важноста на 20% сахароза од иста група од 1x PBS е важна бидејќи резултира со иста позадина на густината на растворот. Доколку двата раствора беа подготвени одделно, малите варијации во густината во PBS може да донесат дополнителни променливи на густината преку додавање на сахароза во експерименталното конусно шишенце. Конечно, испарувањето може да биде проблем бидејќи со текот на времето, како што испарува водата, растворите ќе станат поконцентрирани. Затоа е важно цврсто да ги затворите шишињата и да го редизајнирате решението секоја недела, така што експерименталните решенија остануваат конзистентни.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.