Митохондријални цитопатии - PDF бесплатно преземање

Митохондријални цитопатии Обработка на различна патогенеза на избрани митохондријални цитопатии врз основа на две студии на случај на Кристијан Хаверкамп

митохондријални

Митохондријални цитопатии Обработка на различна патогенеза на избрани митохондријални цитопатии врз основа на две студии на случај Дисертација одобрена од Медицинскиот факултет на Рајниш-Вестфалише Технише Хохшуле Ахен за стекнување со академска диплома на доктор по медицина поднесена од Ларс Кристијан Арндт Симон Хаверкамп од Дуисбург Новинар: рер. нат Герхард Бузе г-дин универзитетски професор др. медицински J. Мајкл Шредер Ден на устен испит: 13.06.2008 година Оваа дисертација е достапна на Интернет на веб-страницата на универзитетската библиотека

Содржина 1 Вовед. 4 1.1 Митохондрија. 4 1.1.1 Оксидативна фосфорилација (OXPHOS). 4 1.1.2 Реактивни видови кислород. 5 1.1.3 Апоптоза. 5 1.2 Структура и организација на митохондријалната ДНК (mtdna). 6 1.3 Примарни митохондропатии. 8 1.3.1 Точки мутации на метдна. 8 1.3.2 Бришење на МТДНА. 11 1.4 Секундарни митохондропатии. 11 1.5 Примарна кардиомиопатија. 12 1.5.1 Дефекти на нуклеарниот ген. 12 1.5.2 Дефекти на митохондријалниот ген. 15 2 Цел на работата. 19 3 Материјал и методи. 20 3.1 Потекло на примероците од ткивото. 20 3.1.1 Контроли. 20 3.1.2 Пациент p1/p2. 20 3.1.3 Пациент p3. 21 3.1.4 Пациент p4. 21 3.2 Подготовка на ДНК од митохондрија. 25 3.2.1 Изолација на мтдна од крв. 25 3.2.2 Изолација на мтдна од мускулно ткиво. 26 3.2.3 Органска лиза. 27 3.2.4 Екстракција на фенол/хлороформ. 27 3.3 Електрофореза со гел. 27

3.3.1 Електрофореза со гел од агароза. 27 3.3.2 Електрофореза со гел на акриламид. 28 3.4 ПЦР. 30 3.4.1 Конвенционален PCR. 30 3.4.2 -ПРЦ на големи растојанија (LPCR). 32 3.5 Редоследување. 33 3.5.1 Прочистување на ДНК. 34 3.5.2 Реакција на секвенционирање. 34 3.5.3 Подготовка на примероците за автоматско мерење. 34 3.5.4 Евалуација на мерењето. 35 3.6 Полиморфизам на ограничување на фрагментот (RFLP). 35 3.6.1 MERRF: Ban-II A8344G. 35 3.6.2 МЕЛАС: Апа-1 А3243G. 35 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G. 36 3.6.4 ЛХОН: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A. 36 3.7 Решенија и бафери. 37 4 резултати. 40 4,1 ЛХОН. 40 4.1.1 Подготовка. 40 4.1.2 ПЦР. 40 4.1.3 Анализа на ограничување. 40 4.2 Кардиомиопатии. 42 4.2.1 Подготовка на микромускули. 42 4.2.2 Подготовка. 43 4.2.3 Скрининг за бришење на LPCR. 43 4.2.4 Редоследување. 45 5 Дискусија. 47 5,1 ЛХОН. 47

5.1.1 Патогенеза. 47 5.1.2 Цитостатска терапија. 51 5.1.3 Литература и конечна евалуација. 54 5.2 Кардиомиопатија. 56 5.2.1 Интергеномска комуникација. 56 5.2.2 Значење на пронајдените промени. 65 5.2.3 Резиме. 67 6 Директориуми. 69 6.1 Список на табели. 69 6.2 Список на бројки. 69 6.3 Список на кратенки. 70 6.4 Библиографија. 73

1.1 Митохондрија Кондензација на хроматин и распаѓање на хроматинот, во која е вклучен и CAD. Отворањето на порите на транзицијата на митохондријалната пропустливост (mtptp) се чини дека доведува до колапс на електрохемискиот градиент, до отекување на внатрешната мембрана и до прекин на надворешната мембрана. Mtptp се чини дека е составен од анденозин нуклеотиден транслокатор (ANT), порин и други фактори како што се Bax (X-протеин поврзан со BCL2), Bcl2 (леукемија на б-клетки/лимфом 2), циклофилин Д и рецептор на бензодиазепин. Отворањето најверојатно е предизвикано од зголемена изложеност на ROS, пад на Ψ или прекумерно внесување на калциум 2-9 Слика 1: Важни метаболички патишта во митохондриумот 1.2 Структурата и организацијата на митохондријалната ДНК (mtdna) Митохондријата се под контрола на два генома. Повеќето од митохондријалните структурни и функционални протеини се кодирани од јадрото, преведени во цитозолот и транспортирани во митохондрионот преку низа на препознавање. 13 протеински под-единици, 22 trnas и 2 rrnas се кодирани од митохондријален геном. Протеините се исклучиво дел од респираторниот ланец: цитохром б, под-единици 1, 2 и 3 од цитохром ц оксидаза, 6-ти

1.2 Структура и организација на митохондријалната ДНК (мтдна) Слика 2: Митохондријален геном и карактеристични мутации 1.3 Примарни митохондропатии 1.3.1 Точки мутации на матната 1.3.1.1 Наследна наследна оптичка невропатија на Лебер (LHON) ЛХОН води акутно во субакутно до слепило преку загуба на централното визуелно поле. Тоа главно ги погодува мажите на средна возраст. Во моментов има 18 познати мутации во митохондријалната ДНК кои ја предизвикуваат болеста самостојно или во комбинација. 1.3.1.1.1 Клинички карактеристики Симптомите обично започнуваат во средината на животот со акутна до субакутна безболна централна загуба на визуелното поле. Фондоскопски, 8

3,6 g ткиво, кое е поделено на делови од приближно 100 mg. Овој дел потоа се третира како микропрепарат 26, индивидуа

3.2 Подготовка на митохондријална ДНК Митохондријалните пелети се обединети. Макси подготовката се користи за да се добијат контролни шаблони. Материјалот за пациентот е по нарачка на

3.4 ПСР-буквари за напред и назад (MWG Biotech) и 1350 μl аква стерилни. Условите на ПЦР за одделните фрагменти се наведени во Табела 5 и Табела 6. Условите на PCR се разликуваат за соодветните фрагменти во однос на температурата на заварување, времето на продолжување и бројот на циклуси. Температура во Целзиус Време во секунди Прва денатурација 94 300 денатурација 94 30 Аннелинг Тан 60 Продолжување 72 Текст Табела 5: Основен PCR профил 31

3.6 Полиморфизам на должината на фрагментот со ограничување (RFLP) 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G Мутацијата на LEIGH T8993C и T8993G се открива со RFLP анализа на фрагментот 7. Моделот на ограничување на Msp-I (Gibco BRL) со местото за расцепување на C ^ CGG за овој фрагмент е прикажано на Сл. MELAS: A3243G див тип MERRF: A8344G мутација див тип 3001 Leigh: T8993C/G мутација див тип 7415 мутација 8363 246bp 3247 1431bp 839bp 839bp 629/630bp 842bp 1185bp 41bp 8254 41bp 8295 4432 9205 Слика 3: Шематски приказ на моделот на ограничување 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A Два различни теста се достапни за RFLP анализата на LHON мутацијата 11778. Мутацијата на LHON доведува до елиминација на едно место на расцепување во ограничувањето на F10 со SfaN-I, и ново место на расцепување во случај на ограничување на Mae III. Користењето на двата тест методи го намалува ризикот од лажен негативен или лажно позитивен резултат. 36

3.6 Полиморфизам со ограничување на фрагментот (RFLP) SfaN I ограничување: GATGC 11450 997 122 12570 122 12570 LHON 11450 318 679 Див тип Слика 4: Модел на ограничување LHON 11778 со ограничување SfaN I Mae III: 11450 200 ^ GTNAC 125 130 58 607 12570 60750 125 255 58 Див тип Слика 5: Шема на ограничување LHON 11778 со раствори MAE III 3.7 и тампон Специфичен фрагмент-мастер мешавина (PCR) 5,55% премаз за прајмер (8 часот на час/100 μl) 5,55% реверзен прајмер (8 чmol/100 μl) 1,11% полимеризација -Помешајте 11,11% 10-пати тафе пуфер 76,66% Аква стерилен пуфер за хемолиза 37

3.7 Раствори и пуфери 10 mm NH4HCO3 144 mm NH4Cl H пуфер 210 mm манитол 70 mm сахароза 1 mm EDTA 5 mm HEPES (раствор од 1M) 0,5% тампон за полнење албумин (гелови од агароза) 15% Ficoll 50 mm EDTA 0,5% SDS 1x TBE 0,1% (w/w) бромофенол сино 0,1% (w/w) тампон за полнење со ксилен цијанол (гелови од полиакриламид) 98% деионизиран формамид 10 mm EDTA, pH 8,0 0,025% бромофенол син 0,025% ксилен цијанол сахароза пуфер 250 mm сахароза 38

3.7 Раствори и пуфери 10 mm TrisCl pH 7,4 1 mm EDTA SDS раствор (0,1%) 0,1% SDS 1 mm EDTA 10xTBE ​​1M Tris-HCl 0,83 М борна киселина 10 mm EDTA прилагодена на pH 8,3 TE пуфер 10 mm TrisCl, pH 8,0 1 mm EDTA 39

4.1 LHON Ова ново место на расцепување е предизвикано од мутацијата на LHON на позиција 11778. Нема остатоци од дивиот тип на опсег (255 б.п.). L K p1 L 607 bp 255 bp 200 bp 125 bp и 130 bp Слика 6: Агарозен гел за раздвојување на фрагментите на ограничување на Mae III Мајката на пациентот p2 исто така ја носи хомоплазматската мутација и во двата клеточни реда. На слика 7 е прикажано варењето на фрагментот 10 (подготовка на леукоцити) со ограничувачкиот ензим SfaN1. Контролата (К) покажува 3 опсези (679 бп, 318 бп и 122 бп). Во испитаниот фрагмент 10 (p2), едно место на расцепување на позиција 11778 е изоставено; опсезите од 679 bp и 318 bp се отсутни. Наместо тоа, се појавува опсег од 997 bp. Овој резултат се согласува со варењето со Mae-III, не е прикажано овде. 41