Молекуларна генетска истрага ширум геном на варијации на бројот на копирање на ДНК (ЦНВ) во
Од Институтот за невропатологија на медицинскиот факултет Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Геномски широк молекуларен генетски преглед на варијации на број на копии на ДНК (CNV) кај холангиоцелуларни карциноми за добивање на академска диплома Doctor medicinae (Dr. med.) Претставен на медицинскиот факултет Charité Universitätsmednoldin Berlin од Александар Раменское датум на докторат: 09.09.2016 година
Слика 1-1 Класификација на подвидовите на холангиокарцином во интрахепатични и екстрахепатични (перихиларни и дистални) врз основа на анатомската локација според класификацијата UICC. Изменето од Blechacz et al, 2011 (10) 1.3 Епидемиологија на холангиокарцином Инциденцата на холангиоцелуларен карцином, што претставува 3% од сите гастроинтестинални тумори, се зголемува ширум светот (12, 13). Сепак, инциденцата варира во голема мера меѓу земјите, со стапка од 1-2/100,000 во Западна Европа и до сто пати поголема во Југоисточна Азија (14). Различни локални фактори на ризик и генетски состојби се сметаат одговорни за оваа несовпаѓање (15). И кај интра- и во екстехепатичните холангиокарциноми, мажите се почесто заболени од жените ширум светот, со сооднос од 1,5 (14). И во двата подтипа, повеќето од засегнатите се постари од 65 години кога се поставува дијагнозата (16). Сепак, пациентите се во земји со поголема инциденца (Југоисточна Азија) 7
Слика 1-2 Макроскопска класификација на интрахепатични холангиокарциноми според Група за студии за карцином на црн дроб во Јапонија (LCSGJ). Blechazc et al, 2011 (10) Во случај на екстрахепатични холангиокарциноми, повторно се прави разлика помеѓу егзофитниот и интрадукталниот модел на раст (42), двата типа се поврзани со периневрална инвазија и вклучување на лимфните јазли (10). За хистолошката класификација на холангиокарциномите, покрај класификацијата на СЗО, постои и сегашното издание на AJCC/UICC, кое ги опишува аденокарциномите како најчеста форма, како и поретки форми (аденосквамозни и сквамозни карциноми, муцинозни, клеточни слични на прстенести прстени, саркоматозни и лимфоматозни варијанти) 43, 44). Најчеста форма на холангиоцелуларен карцином е умерено до добро диференциран аденокарцином, кој се карактеризира со жлезда или тубуларна структура. Тука, кубните или колонообразните анапластично изменети епителни клетки покажуваат еозинофилна цитоплазма со кружни централни јадра. Хетерогените туморски клетки често се шират по wallsидовите на жолчните канали и нервните обвивки (45). 11
За фармаколошката терапија на холангиокарцином, немаше стандардизирана хемотерапија до 2010 година поради недоволни податоци. Монотерапија со гемцитабин, која често се користи, даде само незадоволителни резултати (98). Со студиите на NCRI ABC-01 и ABC-02 од Англија, сепак, основана е потенцијална терапија за поставување тренд, која се состои од гемцитабин и цисплатин за нересецирачки тумори на системот на жолчните канали (99, 100). Резултатите од овие студии исто така може да се потврдат со споредлива студија во Јапонија (101). Моноклоналните антитела, кои специфично интервенираат во молекуларните процеси, се исто така нови терапевтски пристапи (102). Нивните тековни почетни точки и поновите резултати од истражувањето ќе бидат испитани понатаму во делот за дискусија. 19-ти
3 Материјал и методи 3.1 Пациенти и примероци од тумор За индивидуалните прегледи, беа достапни различни колективи на примероци од тумор, кои се детално презентирани. 1. За анализа со помош на сонда за молекуларна инверзија (МИП), се користеа имунохистохемија и флуоресцентна хибридизација на самото место (FISH), 24 примероци на формално-фиксиран тумор, вградени во парафин (FFPE) од архивите на Институтот за патологија, Charité - Universitätsmedizin Berlin. Сите примероци беа утврдени за МИП и имунохистохемиско испитување и 20 избрани примероци за анализата на РИБИ (Табела 3-1). Табела 3-1 FFPE популација на тумор. 21-ви
2. За истрагата со употреба на RT-PCR, 30 крио-зачувани примероци од тумор, кои по хируршкото отстранување беа замрзнати во шок во течен азот и се чуваа на -80 C, од архивите на Клиниката за општа, висцерална и трансплантативна хирургија, Charité - Universitätsmedizin Berlin ( Табела 3-2). Овој колектив вклучува само интрахепатични холангиокарциноми. Табела 3-2 популација на криоасервиран тумор. 22-ри
Благодарение на модерната технологија за мултиплекс, повеќе од 20 000 МИП-процеси можат да поминат низ процесот во еден пристап и на тој начин да бидат анализирани. Слика 3-2 Реакциска секвенца на пристапот на МИП: (1) Врзување на МИП со геномска ДНК (2) Пополнување на празнини со полимеризација (3) Сврзување на хомологните краеви на МИП (4) Егзонуклеазата ги отстранува нереагираните примероци (5) Ослободување на примерокот (6) ) Засилување на MIP со употреба на PCR. Изменето од Харденбол и сор., 2003 (105) 26
Слика 3-3 Резиме на работниот тек на МИП. Изменето според Харденбол и сор., 2003 (105) Материјал и раствори: За да се изврши испитување на МИП, 75 ng од претходно извлечената ДНК од геномски тумор се пренесени во воден раствор. Извршување: Хибридизација на низата OncoScan TM FFPE Express 2.0. Методот на сонда за молекуларна инверзија е спроведен од Афиметикс (Санта Клара, САД) 3.5 Анализа на податоците за бројот на копирање со употреба на софтвер за број на копирање Nexus Секој примерок од низата MIP дефинира локализација долж геномот, што се одредува според интензитетот на флуоресценцијата на MIP волја. Трансформацијата на интензитетот на сигналот во промени во бројот на копирање се нарекува сегментација. Алгоритмот SNP-FASST2, кој го користи софтверот Nexus, го поврзува интензитетот на низата во експериментот со внатрешната контрола и го трансформира со користење на логаритмот до основата 2 (log2). Во овој случај, само контроли се групирани само примероци од не-тумор, кои потоа служат како референтен сигнал со кој се споредува секој примерок од тумор во чекор-по-чекор процес. Соодветно на тоа, бришењето е резултат на одредена локација на СНП 27
во помал интензитет на сигнал во споредба со референцата, додека засилувањето доведува до зголемен сигнал (Слика 3-4). Слика 3-4 Шематски приказ на доделување на интензитетот на сигналот на MIP на локација долж хромозомот. Прирачник за број на копија на Nexus (број на копирање на NEXUS, Biodiscovery, Hawthorne, САД) За секој примерок, овие log2 вредности се прикажани на x-оската како локација на примерокот и на y-оската како вредност на односот на логаритам (Слика 3-5). Слика 3-5 Пример за резултати од експеримент и негово претставување како график долж геномот. Прирачник за број на копирање на Nexus (БРИШЕН НАПРАВЕНИЕ НА NEXUS, Biodiscovery, Hawthorne, САД) 28
Слика 3-6 Шематски приказ на фреквенцијата на алелите Б. Прирачник за број на копирање на Nexus (БРИК НА NEXUS COPY, Biodiscovery, Hawthorne, САД) Овие информации за статусот на бројот на копирање и односот на алели му овозможуваат на софтверот да повикува сигнали за интензитет. Следната табела 3-3 објаснува како треба да се толкуваат сигналите. Во случај на победа со единечна или повеќекратна копија, се очекува да се види алелна нерамнотежа во дијаграмот на алелната фреквенција. Добивката ретко може да биде толку силна што речиси го дислоцира присуството на другиот алел, давајќи слика на LOH. Загубата на копија од алел ќе се појави како LOH додека хомозиготната загуба ќе се појави како тотална загуба на алелот. Комбинацијата на статус на непроменет број на копија и LOH во дијаграмот на алелна фреквенција означува неутрален копија на LOH. Овој процес, исто така познат како унипарентална дисомија (УПД), се јавува кога двата алела ги пренесува едниот родител. 30-ти
Табела 3-3 Резултати што треба да се очекуваат кога се комбинираат статусот на бројот на копирање и фреквенцијата на алелата Б. Прирачник за Nexus Copy Number (NEXUS COPY NUMBER, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Имплементација: Необработените податоци беа анализирани со помош на софтвер за копирање на Nexus 6 (Biodiscovery, El Segundo, CA) со NCBI изграден 36,1 од човечкиот геном. За ова е избран алгоритмот за сегментација на SNP-FASST2. 3.6 Полимеразна верижна реакција (PCR) Техниката in vitro на PCR овозможува насочена репликација на ДНК секвенците кои се врамени со познати ДНК сегменти. Областа на ДНК што треба да се реплицира е ограничена со вештачки произведени буквари кои служат како почетна помош. Букварите се кратки, едножични ДНК молекули кои се комплементарни на краевите на дефинираната низа на ДНК образецот. По првичното денатурирање на двојно-нижената ДНК во две единечни жици и последователното прицврстување на прајмерот, ДНК полимеразата се протега под предодредени услови на реакција и во присуство на 31
IDH-2 напред: 5 -AGAATTTTAGGACCCCCGTCTG-3 IDH-2 обратно: 5 -AAAACCCCACTTCTGGTAAA-3 3.7 Електрофореза со гел од агароза Како резултат на производот PCR, се открива со раздвојување на ДНК-фрагменти со помош на гел-електрофореза. Примената на електрично поле на гелот предизвикува ДНК сегменти да мигрираат во анодата поради нивните негативно наелектризирани фосфатни остатоци. Со помош на стандард, откако ќе се обојат ДНК-опсезите со етидиум бромид, флуоресцентна боја што се интеркалира со ДНК, на одделните ДНК-ленти може да им се додели одредена големина. Материјал и раствори: 2% гел од агароза (SERVA, Хајделберг, Германија) со 100μL етидиум бромид на 100ml гел раствор 50 x TAE пуфер (AppliChem, Дармштад, Германија). Имплементација: Производите на PCR беа натоварени на агарозен гел од 2% и одделени со електрофореза со гел по примена на напон од 100V околу 20 минути. 3.8 Прочистување на PCR за секвенционирање Со цел да се избегне преклопување на сигналот при секвенционирање, производот PCR мора да се прочисти од буквари, вишок нуклеотиди, соли и полимераза Taq пред реакцијата на секвенционирање. 33
Материјал и раствори: 3,85 μl аква стекнување 0,1 μl 1U/μl SAP 0,05 μl 1U/μl 200U/μl Exo I 0,5 μl Exo I пуфер 0,5 μl SAP пуфер 5 μl PCR производ Постапка: За ензимско прочистување, реакционата смеса со вкупен волумен од 10 μL се загреваше во термичкиот циклус на 37 ° C 30 минути, а потоа на 85 ° C. 15 минути. 3.9 Секвенционирање на ДНК Методот на секвенционирање според Сангер и сор. (106, 107), кој е познат и како синџир на завршување на синџирот или метод на дидеоксинуклеотид, можно е да се анализираат едножични cdna и gdna, кои се присутни како една жичка во реакцијата на секвенционирање поради денатурација. Со употреба на етикетирани флуоресцентни дидеоксинуклеотиди (секој од четирите ddntps е поврзан со различен флуоресцентен маркер), реакцијата на секвенционирање може да се одвива во реакциска мешавина, бидејќи откривањето на опсезите за секое од четирите ddntps резултира со различен сигнал во боја. Материјал и раствори: 2 μl буквар од 10 mm TP362/TP363 2 μl ензимски прочистен PCR производ 8 μl аква стекнување 34
Проверете ги засилувањата и загубите во одделите на ДНК. Интерфазите FISH се вршеа на TMA делови со помош на хистолошки комплет за додатоци FISH (Дако, Хамбург, Германија) според упатствата на производителот. Сондите FISH наведени во Табела 3-4 се користеа за откривање на засилувања и бришења. Хибридизацијата се одвиваше во машините за автоматска хибридизација (Дако, Хамбург Германија) и беше kindубезно обезбедена од д-р. Дидо Ленце, Институт за патологија, добротворен фонд - Универзитет Берлин. Табела 3-4 Резиме на употребени сонди FISH Детекцијата и квантификацијата на сигналот се одвиваа на Axio Imager Z1 (Zeiss, Jena, Германија) и софтверот Isis (верзија 5.3.1, MetaSystems, Алтлусхајм, Германија). За да се оцени бројот на копирање на секој поединечен примерок, биле изброени специфичните генски и центромерни сигнали во 20 не-преклопувачки јадра на туморските клетки. Сега ген-специфичните сигнали беа споредени со центромер-специфичните сигнали (број на гени копии: број на хромозомски копии). Засилувањето беше количник> 2,2 и количник 50%. 50
Слика 4-6 Резиме на анализата на мутацијата на IDH-1 и IDH-2 со репрезентативни примери на мутации во гените IDH-1 и IDH-2. 54