Оптимизација на ефикасноста на ендотелијалната диференцијација на човечките ЦД133 позитивни матични клетки -

1 Од Медицинската клиника и Поликлиниката II на Онколошкиот центар на Универзитетскиот медицински центар Хамбург-Епендорф Оптимизација на ефикасноста на ендотелијалната диференцијација на човечки ЦД133 матични клетки позитивна дисертација за добивање на докторска диплома по медицина во медицинскиот оддел на Универзитетот во Хамбург презентирана од Естел Јионго од Камерун Хамбург 2008

оптимизација

2 2 Прифатено од Медицинскиот факултет на Универзитетот во Хамбург на: Печатено со одобрение од Медицинскиот факултет на Испитниот одбор на Универзитетот во Хамбург, Претседавачот: Испитен одбор, 2-ри рецензент: Испитен одбор, 3-ти рецензент: Проф. W. Fiedler Проф. Др. Х. Кабиш Проф. Др. Н. Крогер

4 4 ПРИЗНАНИЕ ПО ФЕДЕРАЛНА ДЕКЛАРАЦИЈА Ј СПИС НА СЛИКИ К ЛИСТА НА АБРЕВИЈАЦИИ ​​Л ЛИСТА НА ТАБЕЛИ

23 23 погодени од хематопоетски матични клетки. За таа цел, дел од клетките треба да бидат обложени на почва што содржи стакло. Друга можност за зголемување на стапката на диференцијација на хематопоетските матични клетки може да се постигне со диференцирање на морфолошки недиференцирани клетки содржани во супернатантите на медиумите. На прашањето дали не-приврзаните клетки би се разликувале ендотелно, треба да се одговори со замена на овие клетки. Други извори на ендотелијални клетки се ЦД14 позитивните, моноцитни матични клетки (Фернандез и сор., 2000) и МНЦ (Мурасава и сор., 2002). Тие треба да бидат изолирани од леукафереза, од палта и од коскена срцевина. Истражувањата треба да бидат ограничени на квантификација на добиените ендотелијални клетки и нивна имунохистохемиска карактеризација. Сите три типа на клетки и свежо изолираните матични клетки од хематопоеза треба да се споредат едни со други во однос на нивното однесување.

24 24 C Материјал и методи 1 Материјал 1.1 Лабораториска опрема Таб.1: Користена лабораториска опрема Извор на набавка Име на производителот Бренд на уредот, Комора за броење на Вертхајм Нојбауер Комора за броење Епендорф, Хамбург Референца 10, 100 и 1000 пипети Forma Scientific, Marietta (САД) Инкубаторско инкубаторско облечено во вода општество за Лабораториска технологија за водена бања со водена бања, Burgwedel Heraeus Instruments, Hanau Lamin Air HB 2448 Varifuge 3.2 RS стерилна работна маса центрифуга Hirschmann лабораториска опрема, батерија Pipetus, помагало за пипетирање Heilbronn Leica, Solms LEICA DM IRB со софтвер за флуоресценција IM50 IMS, Цитцентрифуга Франсфурт Цитоспин 2 Зејс, Јена Аксиоплан Аксиоверт 25 Фомо 3 флуоресцентна превртена микроскоп превртен микроскоп/флуоресценција превртен микроскоп микроскоп

25 Потрошни материјали Табела 2: Потрошен потрошен материјал Извор на снабдување Бектон Дикинсон, Френклин Потрошен материјал стерилни шприцеви Discardit II; 5, 10 и 20 ml езера (САД) BD Falcon, Хајделберг стерилни пипети за еднократна употреба; 1, 2, 5, 10 и 25 ml плочи на бунарско културно култивирање; Мултивел 6, 12, 24 или 96 бунарски ќелии просејуваат цевки за центрифугирање од 40 μm; 15 и 50 ml Greiner, Frickenhausen Eppendorf, Hamburg Heinz Herenz, Hamburg Millipore, Schwalbach Miltenyi Biotec, Bergisch Tubes: 15 и 50 ml реакциони садови; 0,5 и 1,5 и 2,0 ml пипети Пастер 230 мм, стаклен стерифлип (единица за стерилизација за еднократна употреба) Колони за раздвојување MACS LS и MS Gladbach Partec, Münster Paul Marienfeld GmbH и 30 мин. Клеточни сита покриваат чаши Ко KG, Königshofen Lauda слајд Sarstedt, Совети за пипета во Нимбрехт (10, 100 и 1000 µl) Schott, Mainz Shandon Inc., Pittsburgh (САД) Филтри за стакларија за хартија за Cytospin 2 (Filter Cards Thick) VWR International, Стерилни филтри за шприц 0,45 и 0,22 μm (стерилен Диетикон) (Швајцарија) филтер за шприц)

26 Хемикалии и медицински производи Таб. 3: Користени хемикалии и медицински производи Извор на набавка Бакстер, Минхен Биохром АГ, Берлин Биотест, Драјхејх Хемиски/медицински производ АЦД-А раствор за одвојување биокол ​​(Фикол) АБ-серум албумин за човечки серум (ХСА) Камбрекс, Newу erseyерси (САД) Комплет куршуми EGM-2 Fährhaus Handelsgesellschaft Хамбург Гибко, Карлсруе Фарма мбх, хидрокортизон (HC) D-PBS серум за фетални теле (FKS) фунгизон (амфотерицин Б) коњски серум (ХС) IMDM пеницилин-стрептомицин-10-глутамин (протаксин 10-глутамин) (10-глутамин) (10-глутамин) ) Харбор био-производи, хуман фибронектин (FN) Норвуд (САД) ЈТ Бејкер, Филипсбург етанол апсолутен (САД) Милтенји Биотек, Бергиш Гладбах CD133 комплет за изолација на клетки, човечки CD14 микро монистра, човечки MACS BSA Stock Solution R&D Systems, Минеаполис (САД) rhang-1 (рекомбинантен хуман ангиопоетин-1) rhang-2 (рекомбинантен Хуман ангиопоетин-2) Трипан син раствор (0,4%) TEBU, Офенбах bfgf (фактор на раст на фибробласт-основен) EGF (фактор на епидермален раст) Flt-3-лиганд (Flt-3-l, Fms-поврзан со тирозин-киназа 3 лиганд)

27 27 HGF (Фактор за раст на човечки хепатоцити) IGF-1 (Фактор на раст налик на инсулин-I) IL-8 (хемотактички фактор на неутрофили од Интерлеукин-8 или моноцит) SCF (Фактор на матични клетки) SCGF-ß (Фактор на раст на матични клетки) -бета) VEGF (Фактор на раст на васкуларниот ендотел или рекомбинат хуман VEGF165) 1.4 Антитела за анализа на имунофлуоресценција Таб. 4: Користена антитела за човечко обележување Изотип клон Апликација Извор на снабдување Антиген g CD144 - глушец 55-7H1 имун- БД Фарминген, (VE- IgG 1 k хистохемија Сан Диего (САД) Кадерин) FITC vwf (фон- Овци - - Имун- Поврзувачко место, Вилебранд Анти-хистохемија Бирмингем-фактор) Човечки (Велика Британија) IgG средно Тексас Црвена коза - - Имун- acksексон Антитела Анти-хистохемија Имуноистражување, за CD144 глувче Вест Гроув IgG (САД) (H + L)

28 Состав на пуфери и медиум Цитокини што се користат и нивни концентрации Таб. 5: Преглед на употребените фактори и нивните концентрации Фактори Концентрација во добиениот резервен раствор (μg/ml) (ng/ml) bfgf 50 1 EGF Flt-3-l HGF IGF IL rhang-1 (Ang-1) rhang-2 (Ang-2) SCF SCGF-ß VEGF концентрација основни медиуми и пуфери AB-PBS -8 ml PBS -2 ml AB-серумски ерилизен пуфер (стерилен филтриран) -8,29 g NH4Cl (155 mm) -1g KHCO3 (10 mm) -45,2 mg EDTA (0,1mM) -1L H20 EBM ml EGM-2 базален медиум -10 ml FCS -1mL пеницилин/стрептомицин (пенкало/стреп) -100 μl амфотерицин Б.

29 29 EBM-1-80 ml EGM-2 базален медиум -20 ml FCS -1mL пеницилин/стрептомицин (Пен/Стреп) -100 µl амфотерицин Б EBM-2-450mL EGM-2 базален медиум -50 ml FCS -5 ml пеницилин/стрептомицин -2 ml rhfgf-бепарин -500 μl амфотерицин B -500 μl GA-1000 (гентамицин) -500 μl аскорбинска киселина (AS) -500 μl VEGF -500 μl R3-IGF μl хепарин -500 μl rhegf -200 μl хидрокортизонски медиум за проширување (ЕМ; стерилен филтриран) -50 ml LBMCM (медиум за долгорочна култура на коскена срцевина. Dexter TM; Acta Haematol. 1979; 62 (5-6):) -500 μl SCGF-ß (10 μg/ml) -250 μl VEGF (10 μg/ml ml) -250 μl раствор на раствор на фибронектин Flt3-l (10 μg/ml) (за обложување на плочите): -1 mg фибронектин (FN) -1 ml стерилна вода -24 ml PBS MACS пуфер -475 ml PBS -12,5 ml човечки серумски албумин (HSA) -3 ml аква цитрат декстроза А (ACD-A) стоп-медиум (по трипсинизација) за ендотелијални клетки: 20% FCS во базален медиум EGM-2 или во супер медиум

30 30 LBMCM -400 ml IMDM -50 ml серум од фетално теле (FKS) -50 ml коњски серум (HS) -500 μl Хидрокортизон (HC) раствор на раствор на трипсин: -1 ml трипсин -9 ml PBS основен медиум со додавање на цитокини како диференцијациски медиум -LBMCM како основен медиум Табела 6: Преглед на додадените цитокини Додадени цитокини VEGF VEGF + Ang-2 VEGF + bfgf VEGF + EGF VEGF + HGF VEGF + IGF-1 VEGF + IL-8 VEGF + bfgf + EGF VEGF + bfgf + HG VEGF + bfgf + IGF-1 VEGF + bfgf + IL-8 VEGF + bfgf + Ang-2 VEGF + bfgf + EGF + HGF + IGF-1 + IL-8 - EBM-1 како основен медиум Табела 7: Преглед на користениот Фактори и комбинации Додадени цитокини VEGF VEGF + Ang-1 VEGF + Ang-2